米曲霉的研究進(jìn)展

美曲霉是一種好氧菌，屬于半知菌亞門、絲綢、天然氣、海藻、慈姑和海貍。最適培養(yǎng)溫度35~37℃,菌落質(zhì)地疏松,初為白色,產(chǎn)孢子后變?yōu)辄S綠色(有報道指出米曲霉菌落在酸度較大的培養(yǎng)基上呈綠色,在酸度較小的培養(yǎng)基上呈黃色),老化后變?yōu)楹稚恋G褐色。但也有報道發(fā)現(xiàn),米曲霉的孢子顏色并不全都為黃綠色,在日本燒酒的釀造過程中,使用的就是產(chǎn)黑色或白色孢子的米曲霉。米曲霉的分生孢子梗生長在厚壁的足細(xì)胞上,分生孢子頭放射狀,也有少數(shù)為疏松柱狀。頂囊近似球形或燒瓶形,小梗一般為單層,偶爾有雙層,也有單、雙層小梗同時存在于一個頂囊上的。分生孢子幼時洋梨形或卵圓形,成熟后大多變?yōu)榍蛐位蚪蛐?表面粗糙或近于光滑。米曲霉的菌絲由多細(xì)胞組成,是一類產(chǎn)復(fù)合酶的菌株,除產(chǎn)淀粉酶外,還可產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下,將原料中的直鏈、支鏈淀粉降解為糊精及各種低分子糖類,如麥芽糖、葡萄糖等;在蛋白酶的作用下,將不易消化的大分子蛋白質(zhì)降解為蛋白胨、多肽及各種氨基酸,而且可以使輔料中粗纖維、植酸等難吸收的物質(zhì)降解,提高營養(yǎng)價值、保健功效和消化率,廣泛應(yīng)用于各種發(fā)酵工業(yè)。1微生物菌種ndf米曲霉(Aspergillusoryzae),是美國FDA公布的40多種安全微生物菌種之一,是食品釀造中的常用菌株,它不僅產(chǎn)酶種類多,而且酶活高,在食品釀造工業(yè)中發(fā)揮著巨大的作用。1.1-淀粉酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)的研究淀粉酶是指能將淀粉水解成各種低分子糖的酶的總稱,是一種應(yīng)用極廣的酶類。米曲霉具有很強的產(chǎn)淀粉酶的能力,可以高效的利用淀粉質(zhì)原料,是酒曲微生物的重要組成部分,眾多科技工作者都對此進(jìn)行了廣泛而深入的研究。王璐等從紹興黃酒麥曲中分離出產(chǎn)α-淀粉酶的菌株,利用分子鑒定手段確定其為米曲霉。采用離子交換色譜與凝膠過濾色譜,分別對紹興黃酒麥曲中的α-淀粉酶和利用米曲霉固體培養(yǎng)生產(chǎn)的α-淀粉酶進(jìn)行了純化,并對其基本酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究,研究結(jié)果二者基本一致。由此,可以推斷麥曲中的α-淀粉酶主要由米曲霉產(chǎn)生。劉曉蓉等對米曲霉1228產(chǎn)α-淀粉酶的特性及部分酶學(xué)性質(zhì)的研究結(jié)果表明,在初始pH=6.6的條件下,采取3%的接種量,31℃培養(yǎng)108h,所產(chǎn)淀粉酶的酶活最高。該酶的最適作用溫度為55℃,最適pH為5.0,Ca2+對酶有激活作用,Fe2+、Fe3+、Mn2+、Ba2+和Cu2+對其有不同程度的抑制。1.2基于米曲霉蛋白活力的民間組織結(jié)構(gòu)米曲霉產(chǎn)生的蛋白酶包括中性蛋白酶、酸性蛋白酶和堿性蛋白酶,其酶活力的高低將直接影響原料的利用率及產(chǎn)品品質(zhì),因此,大量的研究都是圍繞如何提高其蛋白酶活力而開展的。劉志偉等以豆瓣醬中分離的米曲霉為出發(fā)菌株,研究了該米曲霉產(chǎn)蛋白酶的分布及最佳培養(yǎng)溫度、時間、pH值等,優(yōu)化了米曲霉最佳培養(yǎng)基的組成,使蛋白酶活力比優(yōu)化前提高了22.98%。夏克勝等以馬氏珍珠貝為米曲霉制曲原料,蛋白酶活力為指標(biāo),研究了珍珠貝蒸煮條件、曲料碳源,曲料初始水分含量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間對成曲中性和酸性蛋白酶活力的影響。該實驗得到的最優(yōu)制曲條件為:珍珠貝肉121℃蒸煮10min、曲料初始水分51.89%(m/m),曲精接種量0.5%(m/m)、培養(yǎng)溫度32℃、培養(yǎng)時間46h、珍珠貝肉:面粉=3:1(m/m)。在此條件下,珍珠貝肉成曲的中性蛋白酶活力可達(dá)1494U/g。傳統(tǒng)米曲霉菌株普遍具有產(chǎn)中性蛋白酶和酸性蛋白酶的能力較強而產(chǎn)酸性蛋白酶的能力偏弱的現(xiàn)象,針對此缺點,鄧靜等利用原生質(zhì)體誘變技術(shù)對高產(chǎn)酸性蛋白酶的米曲霉菌株進(jìn)行選育,最終篩選出1株高產(chǎn)酸性蛋白酶的菌株C2,其產(chǎn)酸性蛋白酶活力是原始菌株的135%。1.3酒體表面活性劑米曲霉具有一定的合成脂肪酶的能力,脂肪酶能夠催化酯合成反應(yīng)、轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)、酸解反應(yīng)等反應(yīng),對酒中的主要香氣成分-酯類的形成具有重要影響。同時,脂肪酶還具有只改變反應(yīng)的動力學(xué)平衡而不改變熱力學(xué)平衡及催化作用的特點,恰好能夠在短時間內(nèi)促使酒體中酯、酸、醇達(dá)到相對的平衡,達(dá)到催陳作用。王小花等對米曲霉(AspergillusoryzaeCCUG33812)產(chǎn)胞外脂肪酶的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,篩選出麥芽糖為最佳碳源,蛋白胨為最佳氮源,平平加O為最佳的表面活性劑。該菌株產(chǎn)脂肪酶的最適培養(yǎng)條件為:麥芽糖0.5%,蛋白胨0.5%,橄欖油1.0%,平平加O0.032%,發(fā)酵液初始pH值為6。2“曲”的作用機制中國黃酒和日本清酒不同于法國的葡萄酒和德國的啤酒,屬于用曲霉作糖化劑發(fā)酵的釀造酒。自古以來東方釀酒就有“欲釀酒,必先制曲”的說法,紹興酒釀造中把曲形象地稱之為“酒之骨”,可見曲對酒質(zhì)具有極重要的作用。曲的作用主要有個三方面:一是為酒母和醪液提供酶源,使原料中的淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪等溶出和分解;二是在曲菌繁殖和產(chǎn)酶的同時,產(chǎn)生葡萄糖、氨基酸、維生素等成分,這是酵母的營養(yǎng)來源,并生成有機酸、高級醇及醣類等成分;三是曲香及曲的其他成分,作為酒的前體物質(zhì)賦予酒以獨特的風(fēng)味。2.1黃酒歌黃酒是中國的三大酒之一,“以麥制曲,用曲釀酒”是中國黃酒的特色,也是我國黃酒釀造工藝中的一項傳統(tǒng)操作技藝。2.1.1麥曲的生物處理大部分的黃酒企業(yè)目前仍采用“踏曲”的方式制作傳統(tǒng)麥曲,麥曲中的微生物來自環(huán)境、空氣、制曲用水、制曲工具以及小麥原料等,曲的質(zhì)量受到諸多因素影響,而麥曲中的微生物群落也變得極其復(fù)雜。麥曲在傳統(tǒng)黃酒的釀造過程中既作為糖化發(fā)酵劑,又作為少量釀酒原料和營養(yǎng)物質(zhì)保留在黃酒中,同時麥曲作為一種集生香、增味、成色等諸多功能的復(fù)合生化酶制劑是傳統(tǒng)濃醪液態(tài)發(fā)酵黃酒的重要物質(zhì)保障。因此千百年來釀酒先輩們從實踐中總結(jié)出了“曲乃酒之骨”和“好曲出好酒”的精辟論斷。2.1.2機械化向綠酒發(fā)酵生產(chǎn)的糖化菌現(xiàn)在的黃酒企業(yè)大都還在采用傳統(tǒng)的手工釀造生產(chǎn)方式,相比較機械化的生產(chǎn)方式而言,效率低,成本高、缺乏市場競爭力。而現(xiàn)如今的黃酒行業(yè)就已經(jīng)遇到了這樣的困境,若要擺脫現(xiàn)狀,使黃酒行業(yè)走上健康快速發(fā)展道路,就必須要勇于改革,引入先進(jìn)的生產(chǎn)方式,大力推行機械化黃酒生產(chǎn)模式。米曲霉不僅具有很強的產(chǎn)酶的能力,而且它還對原料具有很好的適應(yīng)性,在生料和熟料基質(zhì)上都能夠良好的生長。這不但可以利用米曲霉進(jìn)行熟料制曲,而且還為黃酒的機械化生產(chǎn)奠定了一定的理論基礎(chǔ)。高永強等對機械化黃酒中爆麥曲的制備進(jìn)行了研究,以米曲霉作為唯一菌種,采用純種通風(fēng)培養(yǎng)法生產(chǎn)爆麥曲。控制科學(xué)便利,質(zhì)量穩(wěn)定,酶活力高,其糖化力可達(dá)2000mg葡萄糖/g.h,符合機械化黃酒釀造要求,釀制的機械化黃酒發(fā)酵正常。但不足之處是不能像自然培養(yǎng)的生麥曲那樣,賦予黃酒獨有的香、醇、爽、鮮的獨有風(fēng)格,因此尚需進(jìn)一步研究和不斷完善。毛青鐘等研究了用米曲霉菌制黃酒生麥曲,制成的純種生麥曲比原生麥曲糖化力和液化力大大提高,實驗室釀酒試驗與原生麥曲接近,其實驗結(jié)果證明用米曲霉菌制純種黃酒生麥曲是可行的。黃酒行業(yè)純粹培養(yǎng)麥曲普遍以米曲霉蘇-16作糖化菌種。蘇-16是從自然培養(yǎng)麥曲中篩選出的優(yōu)良菌株,用該菌種制成的麥曲來釀造黃酒,有原有黃酒的風(fēng)味特色,因而黃酒行業(yè)普遍使用。胡志明等以自然培養(yǎng)的生麥曲為原料,經(jīng)篩選得糖化菌(米曲霉)SJM-1、SJM-2、SJM-3和SJM-4,經(jīng)與蘇-16試驗比較,糖化力和液化力較高(糖化力最高達(dá)1262.7mg葡萄糖/g·h)。制曲產(chǎn)酒試驗結(jié)果顯示,酒質(zhì)明顯改善,是黃酒生產(chǎn)的優(yōu)良糖化菌株。高永強等也對保存的黃酒糖化菌進(jìn)行分離、純化和篩選,并與原始菌種同時制備麩曲和麥曲,并對二者的糖化力和液化力進(jìn)行測定和比較。檢驗結(jié)果表明:篩選后的菌株糖化力和液化力均高于原始菌株。2.2制備成曲工藝制曲是清酒釀造的主要環(huán)節(jié),日本歷來就有一曲二酒母三釀造的說法。清酒曲是以粳米為原料,以米曲霉為菌種,采用純種培養(yǎng)的方法而制成的酒曲。周立平等對日本米曲霉菌株特性及通風(fēng)制曲工藝進(jìn)行了研究,將3株日本米曲霉及5株中國米曲霉菌種進(jìn)行理化性質(zhì)比較,優(yōu)選出1株日本菌株進(jìn)行實驗,結(jié)果表明:(1)日本米曲的培養(yǎng)周期較短,一般48h內(nèi)即成曲。出曲時間可通過檢測總酸變化,在總酸消長曲線達(dá)高值后15h左右即可;(2)培養(yǎng)溫度為32~36℃,不能波動太大;(3)當(dāng)菌株糖化力與液化力同時達(dá)到高峰時,對制曲非常有利。該工藝經(jīng)過通風(fēng)制曲生產(chǎn),其糖化力可達(dá)1200U/g·h所釀的酒符合成品酒質(zhì)量。于軍對青稞清酒釀造工藝進(jìn)行了研究,在酩餾酒和甜醅的釀造基礎(chǔ)上,借鑒清酒和喂飯黃酒的釀造原理,選用青藏高原品質(zhì)優(yōu)良的青稞為原料,以米曲霉2146或3800為糖化菌,清酒酵母(sakeyeast)1296為發(fā)酵菌株,采用“一次酒母,適時添曲,分次喂飯,高濃配料,多邊發(fā)酵”的生產(chǎn)工藝,以酸、甜、苦、澀、辣5種口味均衡調(diào)和為特色,酒液透明,酸甜爽口,醇厚優(yōu)雅,酒精度在12~16%vol之間。李健等采用粳米碎米為原料,以米曲霉為糖化劑,接種清酒酵母,應(yīng)用液態(tài)發(fā)酵法,并結(jié)合現(xiàn)代清酒釀造新技術(shù),開發(fā)研制生產(chǎn)碎米清酒。結(jié)果表明,碎米清酒的出酒率高、澄清透明、淡黃色、酒體協(xié)調(diào)無異味,氨基酸總含量為1.144%,共含有26種香氣成分,各項指標(biāo)完全能夠達(dá)到日本清酒的標(biāo)準(zhǔn)。2.3由微生物所構(gòu)成的認(rèn)識米酒是一種以糯米為主要原料,配合酒曲和水釀造而成的酒飲料。其酒精度為3~14%vol,含有豐富的葡萄糖、氨基酸、維生素、有機酸、多糖等,色澤清透,香氣淡雅,可謂老少皆宜的滋補型飲品。米酒是混合菌發(fā)酵,其質(zhì)量和風(fēng)味的好壞取決于甜酒曲中微生物的群落組成及各菌種之間的代謝關(guān)系,代謝產(chǎn)物與產(chǎn)品的比例關(guān)系等。李貴凡等以優(yōu)質(zhì)糯米為主要原料,采用米曲霉和米根霉(Rhizopusoryzae)純種制曲、發(fā)酵罐復(fù)式發(fā)酵的方法釀造米酒。該酒配方總質(zhì)量比率為350%.全部糧食出酒率[按14%(V/V)成品酒計]平均達(dá)332%,灑質(zhì)清亮透明,色澤微黃,三香(醇香、米香、芳香)融合,優(yōu)雅細(xì)膩,醇和干爽,圓潤豐滿,酒體協(xié)調(diào),具有獨特的米酒風(fēng)格。郝瑩等對陜北傳統(tǒng)米酒酒曲中的微生物進(jìn)行分離、純化、鑒定,在分離得到的17種優(yōu)勢菌株中就包括米曲霉,其液化酶和糖化酶活力分別可達(dá)到701U/g、2538U/g,是生產(chǎn)米酒的理想菌株。2.4菌種共固定化細(xì)胞的制備米曲霉具有酶系豐富,產(chǎn)酶活性高,生長快,適應(yīng)能力強,不產(chǎn)毒素等特點,因而廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)中。劉洪偉對貴州茅臺酒酒曲中5株真菌進(jìn)行了分離、純化。通過觀察菌落形態(tài)與個體形態(tài),參照KlichMA,ReperKB和張紀(jì)忠的方法對5株真菌進(jìn)行了鑒定,其中就有米曲霉。王克明以根霉:釀酒酵母:產(chǎn)香酵母:米曲霉為4:2:2:1配比制備多菌種共固定化細(xì)胞粒子,以10%的共固定化細(xì)胞粒子的接種量,在25℃的條件下發(fā)酵生產(chǎn)米酒,共重復(fù)發(fā)酵30批次,其發(fā)酵產(chǎn)酒、產(chǎn)酸、產(chǎn)酯及還原糖的生成量均表現(xiàn)比較穩(wěn)定,而且30批次發(fā)酵的米酒均保持良好風(fēng)味和口感,菌種共固定化細(xì)胞粒子未見破損,機械強度較好,同時未發(fā)現(xiàn)有雜菌污染。產(chǎn)酒為10%(V/V),制得米酒酒體豐滿,香氣豐富,是一種低度保健的米酒,證明采用根霉、釀酒酵母、產(chǎn)香酵母、米曲霉多菌以一定比例混合固定化細(xì)胞液態(tài)發(fā)酵低酒度米酒是可行的。3微波、蘇-內(nèi)酰胺me曲霉的誘導(dǎo)誘導(dǎo)育種工作酒曲在酒的釀制過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,而性能優(yōu)良的微生物是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)酒曲的前提,所以,菌種選育的工作歷來都受到國內(nèi)外科研人員的高度重視。1971年,Meyrath,J.Bahn等經(jīng)過對米曲霉菌株的誘變得到了高產(chǎn)淀粉酶的菌株。Biesebeke等對米曲霉進(jìn)行誘變育種,結(jié)果表明,突變后菌株產(chǎn)淀粉酶活力提高50%,葡萄糖化酶活力提高近100%,蛋白酶活力提高90%。日本研究人員歷經(jīng)四年零四個月時間成功的破譯了米曲霉基因組,并于2005年12月在《自然》雜志上發(fā)表了分析結(jié)果,這一成果為從微觀領(lǐng)域研究米曲霉打下了一個良好的基礎(chǔ)。我國開展這項育種工作已有50多年的時間了,許多研究機構(gòu)在這方面都做了大量的工作,并取得了可喜的成績。目前國內(nèi)大部分釀造廠一直沿用至今的滬釀3.042米曲霉是林祖申先生在20世紀(jì)60年代用紫外線誘變和高蛋白質(zhì)馴養(yǎng)選育出的,該菌株具有生長快、孢子多,制曲管理容易等優(yōu)點,頗受生產(chǎn)單位歡迎。在近十年的時間里,新的育種方法不斷被嘗試和使用,米曲霉的誘變育種工作也取得了顯著成績。鄧靜等以去壁米曲霉孢子為誘變對象,采用Lic12微波、DES2超聲波復(fù)合誘變,最終選出1株高產(chǎn)酸性蛋白酶的菌株C2,其產(chǎn)酸性蛋白酶活力是原始菌株的135.0%。唐潔等采用原生質(zhì)體融合的方法對米曲霉CICC2339和米曲霉AS3.951菌株的原生質(zhì)體分別進(jìn)行了微波和紫外滅活,然后在融合劑的作用下對滅活雙親進(jìn)行融合,篩選出3株生長速度快且蛋白酶活力高的融合株。廖曉霞等以實驗室保藏的一株米曲霉3042為原始出發(fā)株,經(jīng)自然篩選、紫外線誘變,選育出一株米曲霉U180-26,并進(jìn)一步研究了其粗酶液酶學(xué)性