第四節動物細胞的培養條件和培養基第四節動物細胞的培養條件和培養基為了使細胞培養在體外培養成功，需要一些基本條件：（1）絕對無菌操作：所有與細胞接觸的設備、器材和溶液，都必須保證無菌，避免細胞外微生物的污染（2）足夠的營養供應，排除有害物質包括極其微量的離子摻入（3）適量氧氣供應

（4）隨時清除細胞代謝中產生的有害產物（5）有良好的適于生存外界環境，包括pH、滲透壓和離子濃度等（6）及時分種，保持合適的細胞密度細胞培養的無菌操作二氧化碳細胞培養箱

第四節動物細胞的培養條件和培養基一、動物細胞的培養條件二、動物細胞培養基的種類和組成一、動物細胞的培養條件1、器材的清洗和消毒細胞培養工作中的清洗和消毒的目的是去除任何影響細胞生長的有害因子，防止外來微生物的污染，這是細胞培養成功與否的重要環節之一，決不能掉以輕心1、器材的清洗和消毒器材的清洗：一般來說，需經浸泡、刷洗、泡酸和沖洗四個步驟，用過的器材最好盡快地浸泡在3%的磷酸三鈉溶液內過夜，以除去蛋白質和殘余細胞等污垢經常使用的玻璃器材不一定每次刷洗完之后都要泡酸，但新買的玻璃器材在使用前必須泡酸（配比表見表3-3）。器材刷洗或清潔液浸泡后都必須用水充分沖洗，再用蒸餾水和無離子水沖洗器材的消毒滅菌：主要通過物理方法和化學方法來達到嚴格無菌的操作過程。書中表3-4是細胞培養中常用的消毒劑、濃度和使用場合的列表。盡量避免使用抗生素，但在工業生產中還是經常使用的。對以在細胞培養中是否可以采用抗生素，說法不一多數人認為采用抗生素弊大于利，因為細菌很快會產生抗藥性，以后就很難消除，同時又有人證明，長期使用抗生素，可影響細胞的生理代謝和形態，還會影響細胞內的一些信號通路在實際操作中，尤其是在大規模生產中，為了盡可能避免污染，造成經濟損失，有人仍主張采用抗生素，而且用量差別很大，常用抗生素及其濃度見表3-5按規定在生產中不準使用青霉素和β-內酰胺類（革蘭式陽性細菌）抗生素，其他抗生素是可以接受的，非生產性的實驗不受此規定實驗室中常加的是青霉素和鏈霉素，簡稱雙抗，防細胞污染污染最多的是霉菌和真菌培養器皿動物細胞培養瓶內表面為什么要光滑、無毒？多孔板細胞培養瓶一、動物細胞的培養條件2、水質動物細胞培養對環境中各種因素非常敏感，因此水質的好壞直接影響培養的成功與否微量的有毒元素、過多的金屬離子，以及微生物的污染等，都會危害細胞的生長。因此細胞培養的用水必須進行特殊的處理才能使用蒸餾、離子交換、電滲析、反滲透、中空纖維過濾等單獨使用或配合使用，制備純水，一般要求金屬離子含量很低，電阻值在18M

以上。動物細胞制藥用水，要求去熱源一、動物細胞的培養條件3、pHpH的高低對細胞各種酶的活性、細胞壁的通透性以及許多蛋白的功能都有重要的影響。動物細胞培養的最適pH為7.2~7.4，低于6.8或高于7.6時會對細胞產生不利影響，嚴重時會引起細胞退變甚至死亡。一般來說，傳代細胞比原代細胞對pH變動的耐受性強，細胞量多時比細胞量少時耐受性強。細胞代謝也會造成pH變化，可用緩沖體系來穩定細胞周圍環境的pH。書中給出了部分緩沖體系，可以參考一、動物細胞的培養條件4、滲透壓由于動物細胞缺乏細胞壁，因此外界環境滲透壓的高低波動對細胞的存活有很大的影響不同的細胞對滲透壓波動的耐受性不同，比如原代細胞較傳代細胞敏感通常最理想的滲透壓為290～300mOsm/kg，調整滲透壓采用的是加減NaCl

的辦法。每增加或減少1mg/mL的NaCl可使培養基的滲透壓增加或減少32mOsm/kg4、滲透壓在細胞培養的所有操作中，為了使與細胞接觸的所有液體都保持有較合適的滲透壓和pH，一般都需要使用平衡鹽溶液（balancedsaltsolution,BSS），它由無機鹽和葡萄糖組成。表5-6列出了幾種常用平衡鹽溶液（BSS）組成/g·L-1。一、動物細胞的培養條件5、溫度溫度對微生物和動植物細胞的培養都很重要，但細胞種類不同，培養溫度要求有所不同動物細胞特別是哺乳動物細胞的最佳培養溫度為（37±0.5℃），昆蟲細胞則為27℃溫度過高可引起細胞衰退甚至死亡，過低則會降低其代謝和生長速度，影響產物的產量一、動物細胞的培養條件6、空氣空氣也是細胞賴以生存的必要條件之一。盡管細胞在短時期缺氧時可以通過糖酵解途徑進行代謝獲取能量，但該代謝是不完全的，獲得的能力也是有限的，而且還會大量產生乳酸，使pH值急劇下降，最終引起小的退變和死亡。因此在細胞培養中必須給以足夠的氧氣對于動物細胞來說，它在體內的生存條件一般都低于空氣中氧的飽和值的60%，對氧的消耗為0.006～0.3μmol/106細胞·h-1或0.24mg/106細胞·d-16、空氣一般采用方瓶或轉瓶培養時，只要我們保持瓶內有足夠的空間，即培養液體積不超過總體積的30%，通過液面的空氣交換，就可以保證細胞有足夠的氧，不需要專門通氣。但采用生物反應器大規模培養時，則必須專門通氣，補充氧量過高的氧對細胞生長也會產生不利的影響，甚至是有毒的。

生產中常采用不同比例的O2,N2,CO2和空氣，根據需要加以使用性質微生物細胞動物細胞大小1-10μm10-100μm代謝調節方式內部內部和激素營養要求寬松，可利用多種底物苛刻生長速率倍增時間一般為0.5-2h倍增時間一般為12-60h機械強度較好很差，缺乏保護性細胞壁環境適應好差微生物細胞與動物細胞培養方法的比較

所謂動物細胞培養是將動物組織或細胞從機體取出，分散成單個細胞，給予必要的生長條件，模擬體內生長環境，使其在體外繼續生長和繁殖微生物和動物細胞培養方法的比較微生物細胞動物細胞PH控制添加酸、堿CO2-HCO3緩沖液攪拌速度速度快、范圍廣較慢溶氧控制改變攪拌速度、通氣量、進氣氧濃度改變進入氣體的氧濃度培養基滅菌方法高溫蒸煮過濾培養時間幾小時—幾天幾天—3、4周對水純度的要求較低很高

與微生物細胞培養類似，動物細胞的體外培養有兩種類型：一類是非貼壁依賴性細胞，這類細胞可以采用與微生物培養類似的方法進行懸浮培養；另一類是貼壁依賴性細胞，它們需要附著于帶適量電荷的固體或半固體表面上生長。二、動物細胞培養基的種類和組成細胞種系不同對培養基的要求亦有差異，主要有三類：天然培養基、合成培養基和無血清培養基1、天然培養基：在細胞培養的早期階段使用的培養基，主要為來自天然的材料如血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等天然培養基材料成分復雜、組分不穩定，來源有限，因此不適于大量培養和生產的需要2、合成培養基：1950年Morgan等首先用成分明確的化學試劑配置了第一個合成培養基-199培養基，從而開創了合成培養基的研究使用階段199培養基除了BSS外，還含有53種成分，添加適量的血清后，可廣泛用于多種細胞培養、病毒學、疫苗生產等優點：是成分明確，組分穩定，可大量生產供應，至今已有幾十種商品在市場上供應。動物細胞培養中常用的有BME、MEM、DMEM、HAMF12、RPMI1640以及ISOCOV、199和McCoy等，構成這些培養基的主要成分見書中表3-7BME培養基

BME

：basalmediumEagle(依格爾)

性質：動物細胞培養基，更適用于二倍體或原代哺乳動物細胞培養MEM培養基MEM(低限量基礎培養基，minimumessentialmedium

)一種動物細胞培養基，含Earle(依格爾)’s鹽和L-谷氨酰胺，含碳酸氫鈉，類似于BME培養基，適于支持各種哺乳動物細胞的生長

DMEM(Dulbecco’smodifiedEaglemedium)

培養基DMEM是一種含各種氨基酸和葡萄糖的培養基，

DMEM細胞培養基是在MEM培養基的基礎上研制的。與MEM比較增加了各種成分用量，同時又分為高糖型（低于4500g/L）和低糖型(低于1000g/L)。高糖型有利于細胞停泊于一個位置生長，適于生長較快、附著較困難腫瘤細胞等

這種培養基的特點：

（1）氨基酸含量為依格爾培養基的2倍，且含有非必需氨基酸，如甘氨酸等；

（2）維生素含量為依格爾培養基的4倍；

（3）含有糖酵解途徑中的重要物質——丙酮酸；

（4）含有微量的鐵離子

該類培養基廣泛應用于疫苗生產和各種初代病毒宿主細胞的細胞培養及單一細胞培養;如A9、3T6、BALB/3T3、COS-1、COS-3、COS-7、L6、WEHI-3b等細胞系的培養市售動物細胞合成培養基合成培養基的組成部分（1）氨基酸含細胞生長中所必需的而又不能依靠自身合成的12種必需氨基酸，還有谷氨酸（Glu），Glu幾乎是所有細胞重要的碳源和能源商品中合成培養基最少的是13種氨基酸的EagleMEM培養基最多的是21種的199培養基（2）維生素維生素在細胞培養中還起著特殊的作用維生素A對細胞的貼壁有重要的作用維生素C有抗氧化作用膽堿對細胞膜的完整性有重要的作用，缺少時細胞變圓，以致死亡（3）糖類細胞生長依賴于碳源，它是維持細胞生命活動的能量來源主要的碳源是葡萄糖和谷氨酰胺，當使用葡萄糖時，常需要補充丙酮酸鈉有的培養基還加入核糖和脫氧核糖，以及乙酸鈉等（4）無機鹽無機鹽的作用是保持細胞的滲透壓，緩沖pH的變化，并積極參與細胞的代謝一般合成培養基中加入NaCl、KCl等，用以維持細胞的滲透壓和緩沖pH的變化另外，加入CuSO4,ZnSO4等，用以促進細胞的代謝二、動物細胞培養基的種類和組成上述合成培養基中主要有氨基酸、維生素、糖類、無機鹽以及其它一些特定成分如核酸的前體腺苷、鳥苷等為了給細胞培養以更大的方便，以便于其增殖或貼附生長，常培養基中加入一定量的動物血清，常用的是添加5%~10%的小牛血清，雜交瘤細胞的培養中，血清可能要求的更高，常用10~20%的胎牛血清培養用血清血清的作用機制可能為：（1）提供有利于細胞生長增殖所需要的各種生長因子和激素

生長因子：胰島素、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子

激素：皮質醇、雌二醇、黃體酮、甲狀腺素

（2）提供有利于細胞貼壁所需要的貼附因子和伸展因子

貼附和伸展因子：纖維結合蛋白、軟骨素、昆布氨酸、膠原（3）提供可識別金屬、激素、維生素和脂類的結合蛋白

結合蛋白可與維生素、脂質和激素結合，并將它們帶入細胞

鐵傳遞蛋白可結合傳遞鐵離子它們還可以清除某些毒素和金屬的毒性作用

（4）提供細胞生長所必須的脂肪酸和微量元素

脂肪酸中有磷脂質、膽固醇和前列腺素E等，它們可能與其他的生長因子相結合后起作用

微量元素中有銅、鋅、鈷、鉬、硒等，它們對酶有激活作用，并可保護自由基對DNA的損害

二、動物細胞培養基的種類和組成3、無血清培養基無血清培養基的優點如下：①提高了細胞培養的可重復性，避免，避免了由于血清批之間差異的影響；②減少了由血清帶來的病毒、真菌和支原體等微生物污染的危險；③供應充足、穩定；④細胞產品容易純化；⑤避免了血清中某些因素對有些細胞的毒性；⑥減少了血清中蛋白對某些生物測定的干擾，便于實驗結果的分析缺點：細胞在無血清培養基中易受某些機械因素和化學因素的影響，培養基的保存和應用不如傳統的合成培養基方便目前已經有市售無血清培養基（書中表3-8所示）。無血清培養基中都是在合成培養基內加入不同種類的添加劑所構成，大致有以下幾類：無血清培養基

德國PAN牌CHO細胞無血清培養液PANSERIN604S，培養基不含不明確的溶解產物和任何植物水解產物,不含任何蛋白質。沒有任何動物、人類蛋白或多肽，為表達產品的下游處理工作提供極大方便（1）激素和生長因子：激素方面使用最多的是胰島素，促進糖原和脂肪酸的合成，對細胞生長有刺激作用

細胞生長因子方面使用較多的是表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、神經細胞生長因子等

（2）結合蛋白：最經常被補充的是鐵傳遞蛋白和白蛋白。為了便于純化，有時可用硫酸亞鐵、檸檬酸鐵、葡萄糖酸鐵代替鐵傳遞蛋白

（3）貼附和伸展因子：目前多數無血清培養基只適用于懸浮細胞，真正能用以培養貼壁細胞的很少，也很貴，原因在于它們均缺少必需的貼附和伸展因子，除這些因子外，有的還添加維生素A酸和重組的小肽，它可與細胞的受體結合

（4）其它有利于細胞生長的因子和元素：它們包括有消除氧自由基損害的谷胱甘肽，某些微量元素，如硒等（5）

酶抑制劑：培養貼壁生長的細胞，需要用胰酶消化傳代，在無血清培養基中必不可少須含酶抑制劑，以終止酶的消化作用，達到保護細胞的目的。最常用的是大豆胰酶抑制劑無血清培養基的使用方法目前，血清仍是動物細胞培養中最基本的的添加物，尤其是在原代培養或者細胞生長狀況不良時，常常會先使用有血清的培養液進行培養，待細胞生長旺盛以后，再換成無血清培養液細胞轉入無血清培養基培養要有一個適應過程，一般要逐步降低血清濃度，從10%減少到5%，3%，1%，直至無血清培養。在降低過程中要注意觀察細胞形態是否發生變化，是否有部分細胞死亡，存活細胞是否還保持原有的功能和生物學特性等。在實驗后這些細胞一般不再繼續保留，很少有細胞能夠長期培養于無血清培養基而不發生改變的。細胞轉入無血清培養之前，要留有種子細胞，種子細胞按常規培養于含血清的培養基中，以保證細胞的特性不發生變化為了使細胞適應無血清培養，關鍵是使所培養細胞：

1.處于對數生長中期

2.>90%活細胞率

3.適應時以較高濃度的起始細胞接種

細胞適應無血清培養基的方法1.直接適應——細胞從添加血清的培養基轉換到無血清培養基（SFM）中2.連續適應——分好幾步把細胞從添加血清的培養基轉換到無血清培養基（SFM）中，與直接適應相比較，連續適應趨向對于細胞更加溫和一些

無血清用水特別需要強調的是：配制無血清培養液必須使用高質量的水，如石英玻璃蒸餾器經三次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。因為無血清培養基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保護細胞的大分子，既便水中的有毒物質含量甚微，也可能對細胞產生致死性損害。這是無血清培養能否成功的關鍵因素之一

第五節動物細胞培養的基本方法一、細胞培養的分類

培養細胞的種類：原代培養、傳代培養

培養基的不同：液體培養、固體培養

培養容器的方式：靜止培養、旋轉培養、攪拌培養、微載體培養、中空纖維培養、固定化培養第五節動物細胞培養的基本方法二細胞培養的基本技術1細胞分離為了進行細胞培養，首先要從生物體取得細胞，目前獲取細胞的方法有兩種，離心分離法和消化分離法

1細胞分離①離心分離法：主要用于從含有細胞體液如血液、羊水、胸腹水中分離細胞，一般用800-1000r/min離心5~10min離心速度過高或時間過程，易擠壓細胞使之受損傷或死亡

②消化分離：用消化液消化取自生物體的組織塊，使組織松散成細胞懸液，再經洗滌、分離得到所需細胞

常用的消化液：胰蛋白酶、EDTA、或胰酶-EDTA聯用

其他的消化液：膠原酶、鏈霉蛋白酶、木瓜蛋白酶目前常用的消化液配制①1%胰蛋白酶溶液②0.02%EDTA溶液③胰酶-檸檬酸鹽溶液④胰酶-EDTA溶液動物細胞的培養過程

幼齡動物取動物器官和組織剪碎組織胰蛋白酶處理細胞培養單個細胞動物細胞培養技術是其他動物細胞工程技術的基礎

胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可說明細胞間的物質是什么成份？為什么不用胃蛋白酶動物胚胎或幼齡動物的組織、器官，它們細胞增殖能力強，分裂旺盛，分化程度低，容易培養

思考討論：在動物細胞培養過程中，為什么要用胰蛋白酶對取出的動物組織進行處理？

胰蛋白酶處理動物組織，可以使動物組織細胞間的膠原纖維和細胞外的其他成分酶解，獲得單個細胞用胰蛋白酶分散細胞，說明細胞間的物質主要是蛋白質。動物細胞培養適宜的PH為7.2—7.4，此環境下胃蛋白酶（2.0）沒有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性較高2細胞計數：細胞分離制備成懸液，準備接種時需進行細胞計數另外，在觀察細胞生長變化時，以及觀察藥物對細胞的抑制作用時，也都要反復進行細胞計數

細胞計數方法：①自動細胞計數器計數：

原理：讓一定體積的細胞懸液流經一小孔，并在兩個電極之間通過，此時通過的細胞就會對電極間的電流產生干擾而使得電壓發生變化，這樣就在電子計數器上形成一個信號被記錄下來

特點：電子細胞自動計數器，計數速度快，但無法分辨死、活細胞，還會誤將細胞結團當做單個細胞記錄下來，使計算結果偏低全自動細胞計數分析儀電子細胞自動計數器，計數速度快，但無法分辨死、活細胞②血球計數板計數：最常用，最經濟的計數方法具體做法：……………….計數時細胞染色，可分辨死、活細胞

血細胞計數板計數時細胞染色，可分辨死、活細胞結果分析細胞密度

細胞數/ml＝（4大格細胞數之和/4）×104×稀釋倍數細胞存活百分率細胞活力（％）＝未著色細胞數÷總細胞數×100％a臺盼藍染色：臺盼藍（TrypanBlue，也稱Directblue14）一種死細胞染色用色素

化學名：

3,3’-{[3,3’-二甲基-(1,1’-二苯基)-4,4’-二基]雙(偶氮)}-雙(5-氨基-4-羥基-2,7-萘二磺酸)，四鈉鹽

分子式：C34H24N6Na4O14S4

分子量：960.81

外觀：黑褐色結晶粉末

摩爾吸光度：>69,000(在606nm附近)

染色原理：

細胞損傷或死亡時，臺盼藍可穿透變性的細胞膜，與解體的DNA結合，使其著色。而活細胞能阻止染料進入細胞內。故可以鑒別死細胞與活細胞。嚴格來說，臺盼藍染色檢測的是細胞膜的完整性，通常認為細胞膜喪失完整性，即可認為細胞已經死亡。通過顯微鏡很容易就能識別出死亡的被臺盼藍染色的細胞，并可使用細胞計數器進行計數

臺盼藍主要用來鑒定原代培養細胞時,細胞分離后的存活情況，用0.4%臺盼藍直接染色5-10分鐘，在顯微鏡下觀察即可

臺盼藍染色的一些注意事項：1.臺盼藍對人體有毒

2.臺盼藍染細胞時，時間不宜過長。否則，部分活細胞也會著色，會干擾計數3.臺盼藍染色法對于懸浮細胞來說，還比較方便，對貼壁細胞來說，較為繁瑣。因為要消化，有時，96孔板不一定能消化干凈。而且，該法是測定細胞濃度的方法，與細胞懸液的體積有關，加入的胰蛋白酶或1640要計入終體積。可以說，該法相對準確，可能有一些人為因素的干擾b苯胺黑染色俗稱阿尼林黑或精元。一種直接在棉織物上生成的、不溶于普通溶劑的黑色染料染色時細胞懸液與染液比例同臺盼藍，稍放置后即可鏡檢③結晶紫染色細胞核計數：原理：結晶紫具有低滲，并有鰲合鈣離子的作用，因此可以使細胞分散解離和破碎，細胞核染成藍色該法最經常使用于微載體細胞培養中④四氮唑鹽（MTT）染色計數法原理：活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能將MTT黃色溶液還原成不溶性的藍紫色結晶物，并沉積于細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）和酸化的異丙醇或酸化的SDS等均能溶解細胞中的紫藍色結晶物，用酶聯免疫檢測儀，在490nm波長處測定其光吸收值（OD），可間接反映活細胞數量。在一定細胞數值范圍內，MTT結晶物形成的量與細胞數成正比。此法已廣泛用于生物活性因子的活性檢測、細胞毒性實驗、抗腫瘤藥物篩選和腫瘤放射敏感性測定等3細胞培養時活細胞的觀察檢測①活細胞的觀察檢測方法肉眼觀察相差顯微鏡觀察

細胞在體外培養過程中需要每天觀察，以便及時了解細胞生長狀態、數量改變、細胞形態、細胞有無移動、有無污染、培養液pH是否變酸、變黃、是否更換等。

細胞常規檢查的方法為：肉眼觀察一般常規檢查用肉眼即可觀察，主要看培養液的顏色和