LC/MS定性定量方法與技術

LC-MS定性定量方法與技術1.LC/MS的基本數(shù)據(jù)與信息2.LC/MS定性分析技術3.

LC/MS定量分析技術本講內(nèi)容：LC/MS的基本數(shù)據(jù)與信息LC/MS的基本數(shù)據(jù)與信息基于：MS質(zhì)譜峰的m/z和強度LC色譜峰的保留數(shù)據(jù)與面積LC/MS定性定量分析數(shù)據(jù)定性數(shù)據(jù)TIC（或BPC，EIC等）色譜峰的保留時間（tR）質(zhì)譜及m/z測定數(shù)據(jù)化合物或離子的分子量、實驗式、不飽和度質(zhì)譜峰的同位素豐度比MSn（CID）結構信息“氮規(guī)律”定量數(shù)據(jù)質(zhì)譜峰強度，色譜峰的面積TICBPCLC/MS提供的信息磺胺類藥物的LC/MS

TICEICm/z311.0805磺胺類藥物的MS/MSspecifictosulfadimethoxinecommontoallsulfonamides4GHzResolution121841x1000.511.522.533.544.555.566.577.588.599.5+ProductIon(0.820-0.966min,10scans)(311.08060[z=1]->**)sulfas_10ng_4GHz-016.d156.0760412184156.0108712238156.112269868Counts(%)vs.Mass-to-Charge(m/z)155.78155.8155.82155.84155.86155.88155.9155.92155.94155.96155.98156156.02156.04156.06156.08156.1156.12156.14156.16156.18156.2156.22156.24156.26156.28156.3156.32156.34m/z156.0773m/z156.0119

磺胺類藥物的MS/MS平均分子量（averagemolecularmass）由分子中各元素的（相對）平均原子量計算所得。a“AtomicWeightsoftheElements1987,”

PureAppl.Chem.1988，60：841括號內(nèi)的數(shù)值為測不準水平，主要是同位素豐度的自然變化。例如，氫原子量為1.00794±0.00007

元素原子量a

H1.00794（7）C12.011（1）N14.00674（7）O15.9994（3）F18.998403（9）Na22.989768（6）Si28.0855（3）P30.973762（4）S32.066（6）Cl35.452（9）K39.0983（1）Br79.904（1）I126.90447（3）分子量信息

分子量信息同位素質(zhì)量a天然豐度（%）b1H1.00782503599.9852H2.0141017790.01512C1298.913C13.003354831.114N14.00307499.6315N15.000108970.3716O15.9949146399.7617O16.99913120.0418O17.99916030.219F18.9984032210023Na22.989676710028Si27.976927192.2329Si28.97649494.6730Si29.97377013.131P30.97376210032S31.972070795.0233S32.971458430.7534S33.967866654.2136S35.967080620.0235Cl34.9688527375.7737Cl36.9659026224.2339K38.963707493.258140K39.96399920.01241K40.96182546.730279Br78.918336150.6981Br80.91628949.31127I126.904473100單同位素分子量（monoisotopicmolecularmass）由分子中各元素中豐度最高（最輕）的同位素的（相對）原子量計算所得

高分辨質(zhì)譜和元素組成

如果離子質(zhì)量測定的準確度足夠高，則可以得到該離子確定的元素組成。對于未知物分析，這個方法非常重要，常常稱為“高分辨質(zhì)譜”。其實，儀器的分辨率和質(zhì)量測定的準確度顯然是兩個不同的概念。但是，通常，質(zhì)譜的準確質(zhì)量測定是以高分辨率為前提的。如果儀器的分辨率不高，不能分離名義質(zhì)量（整數(shù)質(zhì)量）相同而準確質(zhì)量稍有差別的離子，則質(zhì)譜測定的是由不同離子重疊而成的質(zhì)譜峰的質(zhì)量。因為每個元素均有特定的準確質(zhì)量，因此，如能準確測定離子或分子的質(zhì)量，就可以計算其元素組成。例如C13H24和C12H22N的質(zhì)量分別為180.1753和180.1879u，相差0.0126u，為了分離這兩個化合物，儀器的分辨率m/Δm應為14300，為了區(qū)分他們，質(zhì)量測定應準確到小數(shù)點后4位有效數(shù)字。但是，隨著待測物質(zhì)質(zhì)量的增加，由各種元素組合成該質(zhì)量的可能性迅速增加，而且其中某些組合的質(zhì)量的差別可能很小，因此，對儀器的分辨率及質(zhì)量測定的準確度的要求更高。

高分辨質(zhì)譜和元素組成

用質(zhì)譜儀的應用程序，根據(jù)儀器測定的質(zhì)量及離子或分子中可能存在的元素，可計算出在一定測定誤差范圍內(nèi)分子或離子的各種可能的元素組成，即實驗式。用準確質(zhì)量計算元素組成時，不能忽略電子的質(zhì)量。質(zhì)量測定的誤差越小，可能的元素組成越少。確定待測物質(zhì)的實驗式或元素組成時，應考慮質(zhì)譜法及其他理化方法提供的各種信息。高分辨質(zhì)譜法也提高了目標化合物篩選和定量測定的選擇性。

同位素豐度

絕大多數(shù)元素在自然界以同位素混合物存在，如天然的碳是98.90%的12C和1.10%的13C的混合物。由于元素的同位素的存在，所以質(zhì)譜峰呈現(xiàn)為同位素峰簇，是各種元素及其同位素組成的表現(xiàn)，他們提供了另一重要性息。在質(zhì)量測定的準確度有限時，根據(jù)同位素豐度數(shù)據(jù)有可能限定元素組成。例如，C10H20和C8H12O2的名義質(zhì)量均為140u，而其在m/z141處的同位素峰相對于m/z140峰的強度分別為11%和8.8%，這是由13C存在的機率所確定的，因而可區(qū)分這兩個離子。應該注意低豐度同位素峰的測定誤差較大，還可能有其他成分的離子與之重疊，所以實際應用有一定限制。

不飽和度

如果分子或碎片的元素組成己知，可計算其不飽和度，包括環(huán)、雙健和叁鍵，故又稱雙鍵相等數(shù)（doublebondequivalents,DBE）。設分子式的通式為CxHyNzOn,,則：DBE=x-(1/2y)+(1/2z)+1鹵素等取代一個H的元素計作H，S計作O,P計作N，Si計作C。在質(zhì)譜法中，此式只適用于分子離子M＋·。偶電子離子，如CH3+比CH4少1個氫，故導致DBE出現(xiàn)半整數(shù)。同理，由M+H+計算所得的中性分子M的DBE應加0.5；(M-H)-計算得到的M的DBE應減去0.5。

“氮規(guī)律”，奇電子離子，偶電子離子

氮規(guī)律指出：含偶數(shù)氮原子或不含氮原子的分子其分子量為偶數(shù)。這是因為氮的質(zhì)量是偶數(shù)（14），而價態(tài)為奇數(shù)。而其他元素的質(zhì)量和價態(tài)要么均為偶數(shù)，要么均為奇數(shù)。在質(zhì)譜中氮規(guī)律指出：不含氮或含偶數(shù)氮原子的任何離子，如為奇數(shù)電子（游離基陽離子或游離基陰離子），其質(zhì)量應為偶數(shù)，反之，若為偶電子離子（陽離子或陰離子），其質(zhì)量應為奇數(shù)。含奇數(shù)氮的離子，如為奇電子離子，其質(zhì)量應為奇數(shù)，如為偶電子離子，其質(zhì)量應為偶數(shù)。

質(zhì)譜解析

質(zhì)譜裂解主要為由游離基驅(qū)動（奇電子離子）的α裂解和由電荷驅(qū)動（偶電子離子或奇電子離子）的誘導裂解（i裂解）引起的兩種基本途徑。軟離子化技術，如ESI等，主要生成準分子離子，如M+H+，M+Na+，[M-H]-，M+Cl-等，這些離子均為偶電子離子，在所得的質(zhì)譜中，準分子離子常常是主峰，沒有或較少碎片峰，因而缺乏結構信息。為了獲得結構信息，主要采用兩種技術，即MS-(CID)-MS（或MSn）及源內(nèi)碰撞誘導解離（insourceCID）。偶電子離子優(yōu)勢裂解反應為丟失一個小的中性分子并生成另一偶電子離子。質(zhì)譜解析的經(jīng)典著作是McLafferty的《InterpretationofMassSpectra》，另外，也有商品化的解析軟件《MassFrontier》等。單鍵裂解伴隨電荷的遷移

CH3-CH2-OH2+

→CH3-CH2++H2O鍵的裂解伴隨環(huán)化及電荷的遷移

環(huán)狀離子斷裂兩個鍵，電荷保留基本的偶電子離子裂解反應（1）

兩個鍵的斷裂，伴隨著重排基本的偶電子離子裂解反應（2）

如烷鏈較長，通過六元環(huán)的γ位氫重排為優(yōu)勢過程，這是發(fā)生在偶電子離子上的McLafferty重排基本的偶電子離子裂解反應（3）

肽產(chǎn)生的離子的命名

磷酸二酯鍵的4種可能的裂解產(chǎn)生8種離子，含5’-OH的離子稱an、bn、cn和dn而含3’-OH的離子稱wn、xn、yn和zn。下標n指示其裂解位置。堿基的進一步丟失用括號表示，如a3-B3（A）表示鍵的開裂發(fā)生在3位的磷酸二酯基的核糖碳原子和氧原子之間并在同一位置進一步丟失了腺苷堿基。寡核苷酸產(chǎn)生的離子的命名為了解釋互補離子an-Bn和wn的形成，提出了幾種裂解途徑，例如：上述裂解途徑中首先通過1，2消除丟失堿基。這一消除可能是由于分子間的堿催化產(chǎn)生的（3’磷酸酯基的帶負電的氧原子）。然后，由這一中間體通過磷酸二酯基的3’C-O鍵的開裂產(chǎn)生an-Bn和wn碎片。

裂解途徑電荷保留在非還原端的碎片稱A、B、C，而電荷保留在還原端的碎片稱X、Y、Z。寡糖產(chǎn)生的離子的命名形成B、Y的機制

形成A、X的機制黃酮苷產(chǎn)生的離子的命名

化合物鑒定用LC/MS鑒定化合物通常分兩個步驟：在樣品中發(fā)現(xiàn)化合物；采集產(chǎn)物離子譜鑒定化合物在復雜樣品中鑒定化合物，有一定挑戰(zhàn)性，低濃度的化合物常被基質(zhì)抑制或掩蓋。化合物鑒定

—基于四極儀器的方法技術如前所述，目前用得最多的還是基于四極原理的質(zhì)譜儀，如QMS、TSQMS、QTrap、ITMS，這些儀器為掃描儀器。此處，主要討論MS/MS的方法。用LC/MS鑒定化合物鑒定時，以質(zhì)譜全掃描作為搜索掃描，觸發(fā)MS/MS掃描。在總離子流或基峰離子流中發(fā)現(xiàn)化合物，用產(chǎn)物離子譜進行結構鑒定。分析同類化合物中的未知物時，可用已知的裂解途徑，進行母離子掃描（PI）或中性丟失掃描（NL）以發(fā)現(xiàn)未知物，然后采集產(chǎn)物離子譜進行結構鑒定。

BuspironeC21H31N5O2MW=385150200250300350400450500m/z255075100RelativeAbundance386408(M+H)+(M+Na)+ESI/MS全掃描圖（Buspirone）Buspirone產(chǎn)物離子譜100150200250300350400m/z255075100RelativeAbundance122386222150265180(M+H)+磺胺類藥物的母離子掃描:Q3固定在m/z122100200300400500m/zRelativeAbundance402386910111213141516Time(min)255075100RelativeAbundance11.6213.8413.1614.4012.1310.4515.45Q3前體離子掃描-尋找代謝物中性丟失掃描中性丟失掃描:Q1/Q3質(zhì)量差為121Da100200300400500m/zRelativeAbundance402386910111213141516Time(min)255075100RelativeAbundance13.9211.6913.2115.5010.58-尋找代謝物-尋找代謝物化合物鑒定

—基于高分辨儀器的技術在化合物鑒定中，高分辨質(zhì)譜儀，如Q-TOFMS等應用日益廣泛，TOFMS為典型的非掃描儀器，記錄輸入的離子的全部信號，釆樣速率和全譜靈敏度高。采集的數(shù)據(jù)可用各種后處理技術，取得有關信息。對于已知化合物，用高分辨質(zhì)譜，可直接在MS和MS/MS譜中提取目標離子，用產(chǎn)物離子譜進行結構確認。進行未知物分析時，可直接在MS和MS/MS數(shù)據(jù)中，用各種數(shù)據(jù)質(zhì)處理技術,如EIC,MDF,IPF,PIF,NLF,BGS,MFE,PCA等，發(fā)現(xiàn)和鑒定未知化合物。此處，以代謝物自動分析為例，說明有關技術。分子信息提取（MolecularFeatureExtract）分子信息（molecularfeature）

指在LC/MS分析中由保留時間、質(zhì)量及其響應所確定的分子實體。分子信息提取（molecularfeatureextract,MFE）質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理方法，在全掃描質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)中，排除干擾，降低數(shù)據(jù)的復雜性，由此產(chǎn)生的化學上合理的分子信息列表：

?Treatsdataasathreedimensionalarrayofretentiontime,m/z,andabundance.?Removespersistentandslowlychangingbackground.?Searchesforfeatureswithacommonelutionprofile(masseselutingatnearlythesametime).?Massesgroupedinto“compounds”.?Co-elutinginterferencesareresolved.?Isotopicclusterrecognizedandgrouped.?Chargestateassignmentsandmolecularadductsarerecognized?2D/3DDatavisualization.?Chemicalidentification(ppm,isotopematching).?Featurelistsstorableinspace-efficientbinaryformat,andsavedastextfiles.分子信息列表用于數(shù)據(jù)庫檢索和/或分子式計算，以及統(tǒng)計分析。MetaboliteIDsoftware鑒定代謝物

分子特征提取技術(MFE)Metlinmetabolitepersonaldatabase

Forover23000endogenousandexogenousmetabolites./

MetablitesIdentification3DPlotBeforeMFE——AutomatedDataReductionSoftwareOriginalTICProcessedTIC3DPlotNoBackgroundDataReducedsumintensitiesofisotopes,adducts,clustersandmultiplychargesionstogether.FindsFeaturesinTOF/QTOFDataCoelutingFeaturesComputed-assistedIdentificationmetabolitesofNefazodone預測Nefazodone的phaseI和phaseII代謝產(chǎn)物及其massshiftMassshiftMetaboliteresults

—expectedandunexpectedmetabolitesExpectedresultsUnexpectedresultsRt9.2min,NefazodonehydroxylationmetaboliteParentdrugMS/MSMetaboliteMS/MSRt9.2min,NefazodonehydroxylationmetaboliteFragmentoverviewofNefandmetbolitesParentdrugMass-to-charge(m/z)RetentiontimeUsingFragmentoverview

tofindpotentialmetabolites代謝物與母藥相同的碎片離子，具有和PIscan相同的功能ParentdrugmetaboliteProposedMetabolicpathwayofNefazodone統(tǒng)計分析和化學計量學數(shù)據(jù)分析Massprofiler兩組數(shù)據(jù)間的差異比較T-testMassprofilerprofessional多組數(shù)據(jù)間的差異比較PCA，PLSA，ANOVAMassProfilerSoftware鑒定代謝物ProcessedTICProcessedTICProcessedTICGroupA(metabolite)ProcessedTICProcessedTICProcessedTICGroupB(Control)AlignsDataRT,Mass,AbundanceAllDataRT/MassWhat’sChanged?Mass/RT>2FoldChangeWhat’sUnique!!Metabolite

ControlDifferentanalysisusingMP化合物SP的膽汁代謝物的鑒定，利用MP進行差異分析，紅色的點代表代謝樣品中獨有的feature，藍色的點代表control樣品中獨有的feature。UsingMetlinpersonaldatebaseIDmetabolitesofSP將MP分析中得到的代謝物樣品獨有的features，帶入自建的Metlindatabase，進行所搜，即可得到可能存在的代謝物。

LC-MS定量分析

LC/MS數(shù)據(jù)采集常用以下形式：總離子流（totalioncurrent,TIC）、選擇離子監(jiān)測（selectedionmonitoring,SIM）、選擇反應監(jiān)測（selectedreactionmonitoring,SRM）。如用掃描儀器，如四極質(zhì)譜儀，TIC的靈敏度較低，所以定量分析通常采用SIM或SRM。但是，為了鑒定化合物，TIC是必需。此時，儀器在一定m/z范圍和時間內(nèi)，采集每次掃描所得質(zhì)譜中的各個離子的信號加和得到總離子強度，對掃描數(shù)或時間作圖，即得TIC。在TIC上的每一點均可顯示一張質(zhì)譜圖。也可用提取離子流（extractedioncurrent,EIC）進行定量分析。即從TIC中提取待測離子的離子流。質(zhì)譜定量數(shù)據(jù)選擇離子監(jiān)測

在SIM方式中，與TIC不同之處在于不是采集完整的質(zhì)譜，而是不斷記錄選定的一個或幾個離子的信號。選擇的離子越少，靈敏度越高，而專屬性則相反，單離子監(jiān)測的靈敏度最高。在實踐中，如果準分子離子（或分子離子）的信號最強，則SIM通常記錄這些離子的信號，否則，記錄其他強質(zhì)譜峰的離子流，選擇的離子應處于質(zhì)譜的高質(zhì)量端，以提高含量測定的專屬性。提高專屬性的另一種方法是使用高分辨質(zhì)譜儀。選擇反應監(jiān)測

SRM是一種串聯(lián)質(zhì)譜技術，在定量分析應用中，常用串聯(lián)四極質(zhì)譜儀（QqQ）。如SIM受到樣品中其他化合物或基質(zhì)背景干擾時，可采用SRM方法。在SRM中，前級質(zhì)量分析器選擇一前體離子，通常為準分子離子或分子離子，該離子用CID等方法使之裂解，然后，用后級質(zhì)量分析器選擇一產(chǎn)物離子，通常為位于高質(zhì)量端的特征離子，記錄其離子流。與SIM比較，SRM顯然有較高的選擇性，排除了本底干擾（化學噪聲），因而有較高的信噪比。如果前體離子的裂解反應不止一個或選擇多個前體離子及產(chǎn)物離子，則稱為多反應監(jiān)測（multiplereactionmonitoring,MRM）。

質(zhì)譜定量方法和內(nèi)標

和其他定量分析方法一樣，質(zhì)譜定量分析可采用外標法和內(nèi)標法。由于內(nèi)標法可減少儀器等一系列的誤差，故最為常用。內(nèi)標物的理化性質(zhì)應盡可能與待測成分一致，有較高的純度，不含待測成分，對樣品是惰性的。內(nèi)標物通常為化學結構類似物，包括穩(wěn)定同位素標記物、同系物和同類化合物。內(nèi)標物應在實驗開始時即加入樣品中，這樣可減少樣品預處理、導入儀器及離子源條件變動等一系列誤差。內(nèi)標物產(chǎn)生的離子的m/z值應與待測物質(zhì)產(chǎn)生的離子的m/z值不同，這樣，即使內(nèi)標物與待測物質(zhì)不能分離，通過監(jiān)測不同m/z的離子流可以準確定量。相反，如內(nèi)標物產(chǎn)生的離子的m/z與待測物質(zhì)產(chǎn)生的離子相同，只要色譜法能夠分離內(nèi)標和待測物，同樣能夠進行定量分析。

四極質(zhì)譜法

飛行時間質(zhì)譜法1用SIM,SRM等方法采用提取離子流(EIC)2隨著選擇監(jiān)測的離子種類提取多種離子檢測靈敏度的增加，檢測靈敏度下降不受影響3為提高專屬性，需同時記提供待測成分的全譜、準錄“定性離子”確質(zhì)量、實驗式、不飽和度、同位素豐度比等信息4低分辨，對tR和m/z相近的高分辨，可定量測定名義離子難以定量質(zhì)量相同而準確質(zhì)量不同

的離子

四極質(zhì)譜法與飛行時間質(zhì)譜法定量分析的比較

BuspironeC21H31N5O2MW=385150200250300350400450500m/z255075100RelativeAbundance386408(M+H)+(M+Na)+ESI/MS全掃描圖（Buspirone）Buspirone子離子譜100150200250300350400m/z255075100RelativeAbundance122386222150265180(M+H)+磺胺類藥物的LC/ESI-MS/MS,SRMMode10pg/mLBuspirone,Spiperone&HaloperidolinBovinePlasma100fgoncolumnBallisticGradientMethod@1mL/min(nosplit)Totalacquisitiontime=1.6min0.60.70.80.91.01.11.21.31.41.51.6Time(min)200040006000800050001000015000Intensity1000200030004000RT:1.00RT:1.061.22RT:1.09Buspirone386

122Area=7929Spiperone396

165Area=10268Haloperidol376

165Area=15744PlasmaContaminantMRM定量

-基于準確質(zhì)量EIC的藥物動力學研究三七總皂苷注射液特征成分的體內(nèi)代謝10ng/mlnotoginsenosideR1EICm/z967.531~967.532

MSspectrumofnotoginsenosideR1EICm/z967.0~968.0三七總皂苷注射液特征成分的體內(nèi)代謝-基于準確質(zhì)量EIC的藥物動力學研究線性范圍：血藥濃度10ng/mL~5ug/mL線性：R=0.9998三七注射液活性成分的血藥濃度測定（R1）三七注射液主要成分藥物動力學曲線三七注射液14個成分藥物動力學曲線克服ESI響應非均一性的一些技術低流動相流速LC-MS:Captivesprayionization(CSI)NanosprayionizationCSIAlowflowionizationtechniquetointegratequantitativeandqualitativesmallmoleculebioanalysisRaguRamanathan,InternationalJournalofMassSpectrometryxxx(2010)xxx–xxxCSIallowstheuseofconventionalHPLCoruHPLCcolumnsandflowratesof0.35–0.6mL/min(beforepostcolumnflowsplitting)andcanbeconsideredasatechniquewhichcanfunctionasananosprayormicrospray.Also,incomparisontoconventionalnanosprayionization(NSI)techniques,setupandmaintenanceofCSIdonotrequire:(1)X,Y,andZpositioningorcamerastoguidethespraypositioning,(2)difficulttocontrolsplitterstodelivernano-flowratiosanddifficulttomaintainnanospraynozzles.EvaluationsusingequimolarmixtureofbuspironeandfourmonoxymetabolitespresentinhumanplasmashowthatLC–CSI-MSisahighlysensitivetechniquethatgivesanearequimolarresponseforthecompoundsusedinthisexample.ComparisonsofLC–ESI-MSdatawiththatobtainedusingLC–CSI-MSshowthatreasonablequantificationofmetabolitesmaybeachievablewithoutusingreferencestandardsoradministrationofradiolabeleddrugs.NanosprayHop,C.E.,Chen,Y.andYu,L.J.,Uniformityofionizationresponseofstructurallydiverseanalytesusingachip-basednanoelectrosprayionizationsource,RapidCommun.MassSpectrom.,19(21),3139,2005.Valaskovic,G.A.,Utley,L.,Lee,M.S.,andWu,J.T.,Ultra-lowflownanosprayforthenormalizationofconventionalliquidchromatography/massspectrometrythroughequimolarresponse:standard-freequantitativeestimationofmetabolitelevelsindrugdiscovery,RapidCommun.MassSpectrom.,20(7),1087,2006.Ramanathan,R.,Zhong,R.,Blumenkrantz,N.,Chowdhury,S.K.,andAlton,K.B.,Responsenormalizedliquidchromatographynanosprayionizationmassspectrometry,J