高密度發酵過程中重組大腸桿菌的應用

重組dna技術與大規模培養技術的有機結合，使大型天然蛋白質產品的原始數量不能大量生產，尤其是磺酸。目前，用于農業的藥物市場增長了5.15%。2003年，全球藥物市場總銷售額約為2500億元，磺酸互補蛋白產品的總銷售額至少為10%。大腸桿菌在重組蛋白質生產的過程中占主導地位。采用高密度培養技術(Highcell-densityculture,HCDC),也就是高密度發酵技術,提高菌體的發酵密度,最終提高產物的比生產率(單位體積單位時間內產物的產量)不僅可減少培養體積、強化下游分離提取,還可以縮短生產周期、減少設備投資從而降低生產成本,能極大地提高在市場上的競爭力。這一目的的實現,除了重組菌本身的表達性質外,還必須賦予重組菌生長和產物表達的最適環境條件,包括適宜的培養基組成、合適的培養溫度、pH、穩定的比生長速率、適宜的溶解氧以及營養物的合理流加等。我們實驗室采用該技術,大大推動了重組人腫瘤壞死因子(TNFα),白細胞介素-3(IL-3),骨形成蛋白-2A(BMP-2A),降鈣素的下游研究。1影響高密度發酵的幾個表觀因素1.1培養基組分與培養方法對發酵的影響培養基的組成成分可分為合成培養基、半合成培養基和復合培養基。其組成元素包括C、H、O、N、S、P、Fe、Mg、K等,根據在基本培養基中的菌體生長量可以推導出每種元素獲得1g/L的大腸桿菌菌體所需的無機鹽(L-1):0.77gNH4Cl,0.125gKH2PO4,17.5mgMgSO4·7H2O,7.5mgK2SO4,0.64mgFeSO4·7H2O,0.4mgCaCl2。大腸桿菌高密度發酵使用的培養基一般為半合成培養基,培養基各組分的濃度和比例要恰當,過量的營養物質反而會抑制菌體的生長,特別是碳源和氮源的比例,如果碳氮比偏小,會導致菌體生長旺盛,造成菌體提前衰老自溶;碳氮比過大,菌體繁殖數量少,細菌代謝不平衡不利于產物的積累;碳氮比較合適,但碳源、氮源濃度高,雖然發酵起始導致菌體的大量繁殖,但發酵后期菌體生長緩慢,代謝廢物過多,增大發酵黏度,影響溶解氧濃度,容易引起菌體的代謝異常,影響產物合成;碳氮比較合適,但濃度過低,會影響菌體的繁殖。這就能解釋為什么單純靠增加營養物質并不能實現高密度。一般而言,大腸桿菌培養時營養的抑制濃度為:葡萄糖(50g/L)、氨(3g/L)、Fe2+(1.15g/L)、Mg2+(8.7g/L)、PO43-(10g/L)、Zn2+(0.038g/L)。如果培養基僅僅適合宿主菌的生長對工程菌高密度發酵而言遠遠不夠,利用合成培養基可以很容易使菌體達到高密度,但往往會發生外源基因不表達的現象。Allen和Luli曾用合成培養基培養重組大腸桿菌,菌體在很短時間(13h)達到了79g(DCW)/L,但外源基因沒有表達。Jung等改變生長階段的C/N比例,對INF-β表達影響不大,而改變誘導后補料中C/N比,則會顯著影響外源基因的表達效率。Tsai等還發現,在IL-2發酵時,在合成培養基中加入亮氨酸會使甲硫氨酸被亮氨酸錯誤取代的幾率從19%降至2%。1.2bmp-2m通過溫度誘導型表達制備重組蛋白,并將其作為發酵核心的表達系統重組菌的表達調控方式對發酵過程有重要的影響,高密度發酵也必須據此而采取相應的控制,遵循外源基因的表達規律和誘導后細菌的生長規律才有可能達到高密度、高表達發酵。適合作為E.coli外源基因表達的啟動子有λ噬菌體啟動子PL、PR、tac、trp、Ipp、lac啟動子,還有一種表達方式,就是組成型表達,無任何誘導劑。從簡化發酵過程操作的觀點看,組成型表達系統最為簡便和經濟,但過早的表達產物往往會對細胞有毒害作用,使宿主菌特有的比生長速率下降,甚至會使細胞死亡,因而工程菌發酵大多還是采用可誘導的啟動子,對于這種工程菌一般采用兩階段培養法,即菌體積累階段和產物表達階段。BMP-2A、IL-2采用溫度誘導型表達體系,重組蛋白在3—4h內達到最大表達量(BMP,2.78g/L;IL-2,1.02g/L),菌體也基本停止生長,而利用tac啟動子在IPTG誘導8—10h菌體還在生長,故化學誘導的重組菌高密度發酵比溫度誘導型的要容易一些。1.3可溶蛋白的代謝大腸桿菌的不同種和亞種對外源基因的表達產物會產生一定的影響。表達產物在大腸桿菌體內有三條路徑可走,第一,形成穩定的天然構象,可溶且有活性,不易被降解;第二,蛋白也是可溶性的,但構象為非天然狀態,易被胞內的各種蛋白酶識別降解;第三,多肽鏈間彼此聚集形成不可溶的包涵體,并且有蛋白酶抗性。因此不同的菌種所含有的宿主蛋白酶種類和數量不同,對表達的產物會有降解作用。相同培養條件下選用E.coliDH1比利用YK537和KS476表達proapoA-I的水平高出2—3倍,發酵密度也高20%—100%。Luli等研究了不同宿主菌在補料分批培養中生物量的積累,E.coliJM105和E.coliB具有產酸少(2g/L),發酵密度高(30g/L)的特點,而MC1060發酵密度僅有10g(DCW)/L。Walle等對兩種常用商業宿主菌E.coliBL21(DE3)和JM109進行了乙酸代謝研究,發現前者的乙酸積累僅是后者的1/4,發酵密度也提高25%。因此在高密度發酵優化時要考慮宿主菌的因素,選取最合適的表達宿主菌。1.4營養對質粒發展的影響質粒的拷貝數首先取決于自身的遺傳特性,同時還受到宿主菌生理狀況及生長環境的影響。一般外源基因的表達量隨拷貝數的增加而提高,但拷貝數足夠大時這種關系就不明顯了。細胞的生理條件會影響質粒的拷貝數,Engberg和Nordstorm發現生長速率增大,質粒的拷貝數下降,認為高比生長速率下,質粒的復制速率跟不上細胞的分裂的速率;Jones研究了營養限制連續培養中營養對拷貝數的影響,連續培養8天,質粒(pBR322和pMB9)沒有丟失,但拷貝數下降了4-5倍,說明營養的限制和缺乏會引起質粒的拷貝數下降。工程菌的質粒分配不穩定和結構不穩定都將導致高密度發酵的失敗。2密度對菌株發酵液黏度的影響在排除所有發酵條件限制的情況下,Riesenberg從理論上計算大腸桿菌發酵所能達到的最高菌體密度為400g(DCW)/L,而Markl等則認為最高的發酵密度為200g(DCW)/L,此時發酵液的25%充滿了長3μm,寬1μm的大腸桿菌;發酵液黏度很高,幾乎喪失流動性。迄今為止,非重組E.coliW3110和生產聚-3-羥基丁酸的重組菌為最高密度的兩例,密度分別為:174g(DCW)/L和175.4g(DCW)/L。表1收集了部分重組菌的高密度發酵。3流加發酵技術重組大腸桿菌高密度發酵成功的關鍵技術是補料策略,也就是根據重組菌的生長特點及產物的表達方式采取合理的營養物流加方式。碳源和氮源是兩種常用的限制性基質,葡萄糖因細菌利用快且價廉易得,已廣泛用作重組菌高密度發酵的限制性基質。大腸桿菌在過量葡萄糖或缺氧的條件下會發生“葡萄糖效應”,積累大量有機酸而影響重組菌的生長和外源蛋白的有效表達。因此大腸桿菌高密度發酵中,合理流加碳源使葡萄糖效應降低,是成功的關鍵。常用的流加模式有三種:即恒速流加補料、變速補料和指數流加補料。在恒速流加培養中,作為限制性基質的葡萄糖是以恒定的速率流加,相對于發酵罐中的菌體來說,營養濃度是逐漸降低的,菌體的比生長速率也慢慢下降,總的菌體量在培養過程中是線性增加的。Pan等通過恒速流加培養,生產人生長激素,菌體濃度達到120OD525;Jung等采用該技術生產干擾素,菌體濃度達到46g(DCW)/L,干擾素比生產率為17mg/g菌體。變流速或梯度增加流加速度可以在菌體密度較高的情況下通過加入更多的營養物質促進細胞的生長,并對產物的表達有利。李民等采用三階段式流加葡萄糖的方式,高密度培養重組菌YK537/pDH-B2m生產骨形成蛋白(BMP-2A),發酵密度達53OD600,BMP-2A產量為2.78g/L發酵液。指數流加技術是一個簡單而又有效的補料技術它能夠使反應器中基質的濃度控制在較低的水平,這可以大大減少乙酸等有害代謝物的生成,菌體以一定的比生長速率呈指數形式增加,還可以通過控制流加的速率控制細菌的生長速率,使菌體穩定生長的同時有利于外源蛋白的充分表達,該技術已廣泛地應用于重組大腸桿菌的高密度培養中生產外源蛋白。另外,為了擬合細菌在發酵罐中的實際生長情況,進一步減少有害代謝物的生成,根據細胞代謝反饋出的信息,配合在線或離線的檢測手段又發展了許多可行的補料技術,見表2。4技術應用中的問題重組大腸桿菌的高密度發酵技術在生產實踐中得到了廣泛應用,并且取得了令人驚喜的成果。但是在該技術實際應用中還存在許多需要解決的問題。其中最為嚴重的就是培養過程中菌體過早地衰老、自溶和外源基因不能充分表達、比活性較低,這主要是細菌產生的有害的代謝廢物對重組菌的抑制作用。乙酸是大腸桿菌的主要副產物,它對細菌生長和產物的表達都有抑制作用。4.1同時分離的有機酸種類及用量分析乙酸的方法很多,有比色法、熒光法、薄層層析法、氣相色譜法、分光法和酶法等,此外近紅外法也應用于乙酸的測定,但這些方法都要經過預分離、衍生化等繁瑣的前處理,能達到同時分離的有機酸種類也較少,遠不如HPLC分析簡便、快捷且選擇性好,準確度高。楊如燕等采用RP-HPLC法,分析了生產突變型人腫瘤壞死因子的工程菌YK537/pSB-TK高密度發酵過程中有機酸的種類和含量,證實了乙酸是發酵中的主要有害產物,并且在乙酸積累少時,更易實現工程菌的高表達、高密度發酵。4.2乙酸pacd的生成當葡萄糖加入量超過菌體生長和二氧化碳生產所需量或在缺氧的條件下便會產生大量的乙酸,特別是在培養時間較長的高密度發酵過程中,問題更為嚴重。乙酸的產生與細胞中的電子傳遞鏈和三羧酸循環有關。Han認為細菌在低比生長速率條件下通過氧化代謝作用產生的能量足以滿足合成和異化作用的需求,不會產生乙酸,而在高比生長速率時,大腸桿菌僅靠氧化代謝不能提供足夠的能量,必須通過乙酸生成途徑儲備ATP和NADH2。乙酸的生成需要兩個關鍵性的酶,磷酸轉乙酰酶(Pta)和乙酰激酶(Ack),它們催化葡萄糖代謝中從乙酰輔酶A生成乙酸的兩步酶促反應。EL-Mansi和Luli假設的乙酸抑制機理為:乙酸在中性pH環境中以離子化(CH3COO-)和質子化(CH3COOH)兩種形式存在,質子化的乙酸具有弱的親脂性可以穿過細胞質膜進入胞內,在胞內(pH7.5)解離成CH3COO-和H+,這樣就降低了膜內的pH值,使膜內外的pH差-ΔpH減小,減弱了質子推動力,產生的能量就被大大減少了,擾亂了細胞的正常代謝和生理活性。4.3減少醋酸積累的對策(1)e.colib和jm十5的比較影響乙酸產生的因素較多。宿主菌的影響因素較大,Luli和Strohl發現在相同培養條件下,不同的宿主菌產生的乙酸量相差3倍。E.coliB菌株比E.coliK菌株產生的乙酸少,發現E.coliB和JM105產酸少,而MC1060產酸較高,并且隨著乙酸量的增加,菌體的生長呈指數下降,這是因為E.coliB乙酸生成途徑中的兩個關鍵酶(Pta和Ack)有一個酶突變了或活性降低了使乙酸的合成受阻。Neway等采用氟乙酸抗性突變體E.coliMM-294(磷酸轉乙酰酶缺陷株)進行IL-2高密度發酵研究,結果該菌株比野生菌產酸少,發酵密度高,IL-2比生產率高。(2)培養基ph值對導致乙酸的影響培養基組成能影響乙酸的產生,特別是碳源的含量影響最大。在基本培養基中大腸桿菌產生的乙酸比在復合培養基中產生的少。Kleman等研究了培養基pH值對產生乙酸的影響,發現重組大腸桿菌W3100在葡萄糖濃度為0.5g/L、pH6.0的培養基中,乙酸生成量為6g/L,而pH7.5為12g/L。另外用甘油取代葡萄糖作為碳源可以降低乙酸的生成。Han等在培養基中加入某些氨基酸(甘氨酸、甲硫氨酸),減輕了乙酸的抑制作用,提高了重組菌的生長速率和重組蛋白的產率。(3)連續培養中的乙酸細菌比生長速率(μ)高乙酸的比生成率就高,一般說來,在合成培養基中,當重組菌的生長速率超過某個臨界值便產生乙酸,在連續培養中,當稀釋率超過0.2h-1才能檢測到乙酸的存在。Riesenberg等控制細菌的比生長速率在0.11h-1,降低乙酸產率,使菌體密度達到110gDCW/L。較低的μ雖然產酸少但同時又對產物表達不利,因此選取合適的μ才能達到高密度、高表達發酵。(4)proapoa-i重排液酶系統將溫度從37℃降低到26—30℃可以降低菌體對營養物的吸收率,從而減少有機酸的形成,重組E.coliKS467誘導產生ProapoA-I的溫度從37℃降低到30℃,可將乙酸的濃度從10g/L降到5g/L。(5)重組菌的制備在重組菌的培養過程中可以利用透析技術除去發酵液中有害物質,降低乙酸的含量從而實現重組菌的高密度發酵。Lee等用中空纖維膜過濾裝置除去乙酸可以在較高的葡萄糖濃度下培養重組菌而得到較高的密度。(6)ph和do-stat利用葡萄糖為碳源培養重組大腸桿菌時要控制其濃度在較低的范圍內,減少乙酸的生成。目前大多數高密度發酵均采取了限制性流加葡萄糖的方法。利用發酵反饋的參數,如pH,DO,μ,OUR,CER作為控制對象,和葡萄糖流加相關聯,控制流加量,使培養基中葡萄糖濃度限定在較低的水平。除直接檢測控制葡萄糖濃度外,還有以下幾種方法。A,恒pH值法大腸桿菌代謝葡萄糖產生的有機酸將導致pH的降低,因此pH的下降在一定程度上反映了菌體消耗葡萄糖的快慢,故可以通過pH變化控制、調節補糖速率。該方法的缺點是pH變化不完全是葡萄糖代謝的結果,容易造成補料體系的錯誤。B,恒溶解氧法在菌體利用營養物生長代謝時,會消耗氧氣,反應出溶液中溶解氧的下降,并且溶解氧下降的快慢間接反映了細菌生長的旺盛程度。當葡萄糖濃度降低到一定程度使菌體代謝強度下降,消耗氧氣的能力降低,反映出溶解氧的上升,因此根據溶解氧曲線補加葡萄糖,保持溶解氧恒定,可以使葡萄糖濃度控制在較低的水平。C,平衡DO-stat法發酵過程溶解氧水平和糖流加速率對重組菌的糖酵解過程和代謝物氧化過程之間的平衡有很大的影響。缺氧將迫使糖代謝進入酵解途徑,補糖速率過快也會使糖酵解速度和代謝氧化速率之間的平衡破壞,當碳源的供給超過其氧化容量時,將迫使葡萄糖酵解產生部分中間產物,在有氧情況下產生有機酸。DO-stat通過控制溶解氧防止氧氣缺乏下產生有機酸,但是DO-stat無法阻止有氧情況下的“葡萄糖效應”。平衡D