主講教師:任國領(lǐng)生命科學學院第三章

基因克隆載體基因克隆載體概述DNA克隆載體通過不同途徑將承載的外源DNA片段（基因）帶入受體細胞且能在其中維持的DNA分子。也稱DNA克隆載體。1、具有多種單一核酸內(nèi)切酶切割位點（多克隆位點）

(一個或多個)外源DNA插入，不影響載體復制。2、能攜帶外源DNA片段進入受體細胞

能自我復制，或整合到染色體隨受體細胞DNA復制而復制。3、有選擇克隆子的標記基因（篩選標記）。必備條件基因克隆載體概述4、分子量小，拷貝數(shù)高，易從宿主細胞中分離。5、安全性(不含損害受體的基因,不任意轉(zhuǎn)入別的,尤其人的細胞)。基因克隆載體概述必備條件基因克隆載體概述分類基因克隆載體概述基因工程常見的載體有5類：質(zhì)粒（Plasmid）單鏈DNA噬菌體M13λ噬菌體的衍生物柯斯質(zhì)粒（comsid）動物病毒（Virus）3.1質(zhì)粒克隆載體一、質(zhì)粒（Plasmid）獨立于染色體外能夠自主復制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子（少數(shù)為線狀）。大腸桿菌質(zhì)粒3.1質(zhì)粒克隆載體一、質(zhì)粒（Plasmid）質(zhì)粒性質(zhì)3.1質(zhì)粒克隆載體一、質(zhì)粒（Plasmid）3.1質(zhì)粒克隆載體二、質(zhì)粒適于載體構(gòu)建的一般特點１、組成與構(gòu)型質(zhì)粒(plasmid)是染色體外裸露的雙鏈DNA分子（細菌、真菌、藍藻、綠藻）。構(gòu)型：l-DNAoc-DNAccc-DNA２、分子小1～200kb大小差異很大，一般在10Kb左右。3.1質(zhì)粒克隆載體二、質(zhì)粒適于載體構(gòu)建的一般特點3、復制特點3.1質(zhì)粒克隆載體二、質(zhì)粒適于載體構(gòu)建的一般特點特點：在宿主細胞內(nèi)進行單向復制。拷貝數(shù)（細胞內(nèi)質(zhì)粒與染色體數(shù)量之比值）（１）每種質(zhì)粒在其宿主細胞內(nèi)的拷貝數(shù)相對穩(wěn)定。 嚴緊控制型：1～數(shù)個拷貝；大質(zhì)粒 松馳控制型：10個以上拷貝；小質(zhì)粒。經(jīng)氯霉素處理，宿主中質(zhì)粒大量擴增（如ColE1拷貝數(shù)達3000個）。3、復制特點3.1質(zhì)粒克隆載體二、質(zhì)粒適于載體構(gòu)建的一般特點（２）質(zhì)粒復制的控制因素cop基因：指令宿主合成阻遏物，當質(zhì)粒復制到一定拷貝數(shù)時，阻遏物也合成積累，直到阻止質(zhì)粒的繼續(xù)復制。3、復制特點3.1質(zhì)粒克隆載體二、質(zhì)粒適于載體構(gòu)建的一般特點rep基因：指令宿主合成一種調(diào)節(jié)蛋白，促進質(zhì)粒的復制3、復制特點3.1質(zhì)粒克隆載體二、質(zhì)粒適于載體構(gòu)建的一般特點

par序列：

附著在細胞膜上，使質(zhì)粒隨細胞分裂而正確地分配到子細胞中，維持相對穩(wěn)定的拷貝數(shù)。４、質(zhì)粒的不親合性3.1質(zhì)粒克隆載體二、質(zhì)粒適于載體構(gòu)建的一般特點親和性質(zhì)粒：能在同一細胞中復制的幾種質(zhì)粒不親和性（不相容性）質(zhì)粒：不能在同一細胞中復制的質(zhì)粒。意義：宿主細胞內(nèi)的原有質(zhì)粒與克隆載體的質(zhì)粒必須是親和性質(zhì)粒，最好不含內(nèi)源性質(zhì)粒。４、質(zhì)粒的不親合性3.1質(zhì)粒克隆載體５、質(zhì)粒遷移3.1質(zhì)粒克隆載體二、質(zhì)粒適于載體構(gòu)建的一般特點（１）接合質(zhì)粒：含tra基因→合成細胞表面物質(zhì)（鞭毛）→質(zhì)粒DNA入受體細胞

含tra基因的質(zhì)粒稱為接合質(zhì)粒。如F、Ti等

不含tra基因的質(zhì)粒稱為非接合質(zhì)粒。如ColE1、pPbS等（２）遷移作用：不含tra基因而含bom（oriＴ）位點的質(zhì)粒，當宿主細胞存在輔助質(zhì)粒mob基因產(chǎn)物時，即可打開oriＴ位點，非結(jié)合質(zhì)粒借助接合質(zhì)粒tra基因的產(chǎn)物而遷移入受體細胞。這種現(xiàn)象稱～質(zhì)粒的遷移作用５、質(zhì)粒遷移3.1質(zhì)粒克隆載體二、質(zhì)粒適于載體構(gòu)建的一般特點６、顯性質(zhì)粒和隱蔽質(zhì)粒3.1質(zhì)粒克隆載體二、質(zhì)粒適于載體構(gòu)建的一般特點宿主因含某種質(zhì)粒而呈現(xiàn)出新的性狀，稱為顯性質(zhì)粒。顯性質(zhì)粒 Ｒ質(zhì)粒：含有氨芐青霉素Ap/Amp（抗性質(zhì)粒）

氯霉素Cm/Cap

卡那霉素Km/Kan

四環(huán)素Tc/Tet

Col質(zhì)粒（產(chǎn)大腸桿菌素）Ｆ質(zhì)粒（引起細胞結(jié)合的育性質(zhì)粒） 降解毒物的降解質(zhì)粒Ｔi質(zhì)粒隱蔽質(zhì)粒

藍藻內(nèi)源質(zhì)粒能夠催化雙鏈DNA片段緊靠在一起的3’羥基端與5’磷酸基團末端之間形成磷酸二酯鍵，使兩末端連接起來的酶。DNA連接酶兩種類型（1）E.coliDNA連接酶（2）T4DNA連接酶知識回顧DNA重組類型知識回顧插入重組：外源DNA片斷兩端具有相同的末端，待重組的DNA分子用某種限制性核酸內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生與外源DNA相同的末端，并且這種限制性核酸內(nèi)切酶在此DNA分子上只有一個識別序列。置換重組外源DNA兩端具有相同的末端；待重組DNA這樣的限制性內(nèi)切酶有兩個識別序列，酶切后與外源DNA連接，產(chǎn)生重組DNA分子。1.DNA連接酶連接作用的特點正確的是（）多選題知識回顧A.DNA連接酶需要一條DNA鏈的3’－末端有一個游離的羥基（－OH），另一條DNA鏈的5’－末端有一個磷酸基（－P）的情況下，才能發(fā)揮連接DNA分子的作用。B.只有當3’－OH和5’－P彼此相鄰，并且各自位于與互補鏈上的互補堿基配對的兩個脫氧核苷酸末端時，DNA連接酶才能將它們連接成磷酸二酯鍵。C.DNA連接酶不能連接兩條單鏈的DNA分子或環(huán)化的單鏈DNA分子，被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分。D.DNA連接酶可以用以封閉雙鏈DNA的某一條鏈上失去一個或數(shù)個核苷酸所形成的單鏈裂口（gap）。ABC

DNA克隆載體通過不同途徑將承載的外源DNA片段（基因）帶入受體細胞且能在其中維持的DNA分子。也稱DNA克隆載體。知識回顧1、具有多種單一核酸內(nèi)切酶切割位點（多克隆位點）

(一個或多個)外源DNA插入，不影響載體復制。2、能攜帶外源DNA片段進入受體細胞

能自我復制，或整合到染色體隨受體細胞DNA復制而復制。3、有選擇克隆子的標記基因（篩選標記）。必備條件知識回顧4、分子量小，拷貝數(shù)高，易從宿主細胞中分離。5、安全性(不含損害受體的基因,不任意轉(zhuǎn)入別的,尤其人的細胞)。知識回顧親和性質(zhì)粒不親和性質(zhì)粒能在同一細胞中復制的幾種質(zhì)粒。不能在同一細胞中復制的質(zhì)粒。不含tra基因而含bom（oriＴ）位點的質(zhì)粒，當宿主細胞存在輔助質(zhì)粒mob基因產(chǎn)物時，即可打開oriＴ位點，非結(jié)合質(zhì)粒借助接合質(zhì)粒tra基因的產(chǎn)物而遷移入受體細胞。這種現(xiàn)象稱～遷移作用知識回顧１、能進行有效復制——復制起始位點（最好是多拷貝）復制子由復制起點、復制區(qū)、復制終點組成。是能夠進行獨立復制的一種遺傳因子。每一個復制子都含有一個特定的RNA聚合酶結(jié)合的序列和DNA復制起始部位，即開始復制的復制區(qū)。3.1質(zhì)粒克隆載體三、質(zhì)粒載體的構(gòu)建用來插入外源DNA片段，且不影響復制。2、標記基因——抗性基因，LacZ’基因篩選的標志，理想的載體應該有兩種抗菌素抗性的基因。3、克隆位點——組裝MCS連桿3.1質(zhì)粒克隆載體三、質(zhì)粒載體的構(gòu)建3.1質(zhì)粒克隆載體三、質(zhì)粒載體的構(gòu)建４、分子盡可能小（轉(zhuǎn)化率高），

＞15kb轉(zhuǎn)化率↓↓５、組裝各種“元件”，如啟動子、終止子等3.1質(zhì)粒克隆載體三、質(zhì)粒載體的構(gòu)建嚴密的實驗設(shè)計→構(gòu)建（切割、修飾和連接重組）過

程構(gòu)建原則

1、選用合適的出發(fā)質(zhì)粒：含必備的元件，如ori、選擇標記、

克隆位點、啟動子和終止子。 2、正確獲得構(gòu)建質(zhì)粒克隆載體的元件。 3、組裝合適的標記基因。 4、選用合適的啟動子。 5、構(gòu)建過程力求簡單。1、pBR322構(gòu)建

目標是縮小基因組的體積，移去一些對基因克隆載體無關(guān)緊要的DNA片段，限制酶識別位點。質(zhì)粒載體命名法則 “pBR322”

p：質(zhì)粒（plasmid) BR：兩位主要構(gòu)建者 322：實驗編號3.1質(zhì)粒克隆載體四、代表性實例（一）pBR322及其衍生載體ColE1

松馳型，篩選系統(tǒng)復雜。

衍生的pMB1為出發(fā)質(zhì)粒（松弛型復制起始位點，但缺較好的選擇標記基因和克隆位點）。

pSC101（最早用于DNA克隆的載體），嚴緊型，含有Tcr基因。構(gòu)建過程(出發(fā)質(zhì)粒：pMB1)

2、pBR322優(yōu)點（1）較小的分子量10kb以內(nèi)DNA分子純化過程中可避免斷裂，pBR322易于自身純化，且可克隆6kb左右的外源DNA。（2）較高的拷貝數(shù)經(jīng)氯霉素擴培后達1000～3000copys/cell（3）兩種抗菌素抗性基因插入失活，分兩次先后選擇。3.1質(zhì)粒克隆載體四、代表性實例（二）、pUC18/19質(zhì)粒載體與pBR322區(qū)別：乳糖操縱子的一個DNA片段（lacZ`基因）替換Tcr基因；組裝了一個多克隆位點（MCS）連桿。命名pUC——UniversityofCalifornia的科學家首先構(gòu)建。

圖3-3pUC包括四個組成部分：（1）復制起點pBR322的ori。（2）Apmr基因pBR322的Ampr。（3）lacZ的啟動子大腸桿菌（4）在lacZ`基因大腸桿菌lacZ的a-肽鏈序列，是LacZ的氨基酸片段。

含乳糖操縱子的啟動子、調(diào)節(jié)因子和 β-半乳糖苷酶的N端146殘基(α-肽)合成有活性的基因（lacZ`）的質(zhì)粒載體引入可編β-半乳糖苷酶碼C端部分殘基的宿主(與LacZ`互補的大腸桿菌) 在含IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）和 X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖）藍色菌落 的誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)在N端α-肽的編碼區(qū)插入MCS不影響lacZ`基因功能插入外源DNA滅活lacZ`基因白色菌落LacZ`篩選機制：pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點分子量更小、拷貝數(shù)更高篩選方便X-gal顯色、抗菌素雙重直接選擇。克隆便利具有多克隆位點（MCS），使兩個不同粘性末端的外源DNA方面的插入。測序方便TA克隆載體——針對PCR產(chǎn)物的克隆原理PCR產(chǎn)物在Taq酶的非模板依賴活性作用下，于3`端加一非配對的A。故可研制一種線性載體，其5`端各帶一不配對T，可直接與PCR產(chǎn)物以TA連接進行克隆，即TA克隆。TA載體的再生方法（1）克隆載體線性化（2）克隆載體末端補平反應（3）克隆載體末端加T反應注：再生后的TA載體，原線性化的酶切位點消失3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、病毒的一般特征病毒基本結(jié)構(gòu)DNA（或RNA）+外殼蛋白感染細菌的病毒，稱為噬菌體。分類溫和性病毒：溶原性增殖烈性病毒：溶菌性增殖生活周期

溶菌周期

感染細菌后立即在菌體內(nèi)復制和合成蛋白質(zhì)外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并導致細菌細胞解體，釋放出大量子代噬菌體。3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、病毒的一般特征溶源周期

感染細菌后，將自己的DNA整合到細菌的染色體DNA中。形成這一過程稱為溶源化。生活周期

3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、病毒的一般特征噬菌體載體單鏈噬菌體載體----M13雙鏈噬菌體載體----λ噬菌體cosmid克隆載體3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、λ噬菌體克隆載體λDNA+外殼蛋白1、λDNA(48.5kb)噬菌體中：線性宿主細胞：環(huán)狀(cos位點)3.2病毒（噬菌體）克隆載體（一）性質(zhì)cos位點2、λ噬菌體基因組有基因61個以上 有一半是必須的，與自身的活動有關(guān)，成簇排列；大約1/3為非必須的，J與N、P與Q之間為非必需序列3.2病毒（噬菌體）克隆載體（一）性質(zhì)3、限制性核酸內(nèi)切酶位點:56種

4、λ噬菌體的生長途徑

溶菌生長途徑

溶源生長途徑5、λDNA的復制模型

復制

滾環(huán)式復制

3.2病毒（噬菌體）克隆載體（一）性質(zhì)進入溶原狀態(tài)時，只有少量基因表達，包括編碼阻遏物的cI基因（抑制裂解基因的表達），正向調(diào)控自身基因的表達；int基因的表達（整合到基因組）。

研究E.coliDNA復制時，采用3H標記的T，經(jīng)放射自顯影和電子顯微鏡拍照，展示了“θ”形結(jié)構(gòu)而得名。3.2病毒（噬菌體）克隆載體

這種復制方式在下列生物DNA中有：（1）噬菌體：M13、φ

174、G4、λDNA基因復制。（2）細菌：E.coliDNA、細菌致育因子F。（3）真核生物：非洲爪蟾卵母細胞rDNA的復制。3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、λ噬菌體克隆載體滾環(huán)復制過程（1）雙鏈環(huán)狀DNA的（+）鏈從“ori”處切刻開。5’-端離開環(huán)。(-)5’ori（+）3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、λ噬菌體克隆載體

DNA聚合酶以（-）鏈環(huán)為模板，從（+）鏈的3’-OH端共價延伸，合成子代（+）鏈DNA。(-)5’3’(2)SSB覆蓋在（+）鏈的5’-端單鏈上，（+）3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、λ噬菌體克隆載體

(4)DNA聚合酶以延伸的單鏈DNA為模板，合成子代雙鏈DNA。(-)5’3’3’5’(3)象拉卷尺一樣，（+）鏈越拉越長。67（+）3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、λ噬菌體克隆載體

(5)連接各崗崎片段，子代DNA形成線狀或環(huán)狀。(-)5’3’3’5’68（+）3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、λ噬菌體克隆載體3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、λ噬菌體克隆載體1、λ噬菌體是一種溫和噬菌體對大腸桿菌有很高的感染性，以原噬菌體的形式長期潛伏在溶原細胞里，容易保存。在一定條件下又可轉(zhuǎn)入溶菌生長途徑，進行大量繁殖。2、能承載較大的外源DNA片段 λDNA頭部可包裝約36.4～51kb(自身的75%～105%)，且約有20kbλDNA可缺失（生長非必需）3、在λDNA上有多種限制性內(nèi)切酶位點（二）構(gòu)建依據(jù)3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、λ噬菌體克隆載體策略:切去部分非必需區(qū);刪掉多余的限制性內(nèi)切酶位點;插入選擇性標記基因;建立體外包裝系統(tǒng)。3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、λ噬菌體克隆載體（三）構(gòu)建的基本策略與技術(shù)路線技術(shù)路線1、用限制性酶切去非必需區(qū)，抹去多余識別位點 選定一種酶，以gtWES–λβ為例，EcoRI（如圖）。 （48.5kb）λDNAEcoRI6個片段 A=21.6B=4.9C=5.5D=7.5E=5.9F=3.3

B片段是λ噬菌體生長非必需的； C片段缺失可阻斷溶原生長途徑，但不影響溶菌途徑； E片段去掉不影響溶菌生長途徑的min5序列（2.6kb）。

兩端EcoRI別點經(jīng)點突變或甲基化處理，即得gtWES–λβ：（48.5-5.5-2.6=40.4kb）克隆能力： 替換B（置換重組）：最大：51-(40.4-4.9)=15.5kb

最小：36.4-(40.4-4.9)=0.9kb插入B的任一側(cè)（插入重組）最大：51-40.4＝10.6

最小：無 實際應用時克隆能力略有出入 2、在λDNA的非必需區(qū)內(nèi)插入選擇標記基因 （1）取代red和gam基因 外源DNA取代獲Spi-表型

在P2噬菌體溶原性細胞中能生長

野生型λ噬菌體(Spi+表型)

在P2噬菌體溶原性細胞中不能生長 局限性：只能以P2噬菌體溶原細胞作為受體（2）最常用的篩選標記：LacZ基因3、建立重組λDNA分子體外包裝系統(tǒng)體外重組DNA分子必須經(jīng)體外包裝成噬菌體顆粒后，才能轉(zhuǎn)導受體細胞。在試管中與λ噬菌體的頭部和尾部蛋白人工裝配成噬菌體顆粒，才能高效地感染大腸桿菌，把重組DNA注入受體菌。（四）λ噬菌體克隆載體的應用（自學） 建立cDNA基因文庫克隆外源目的基因3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、λ噬菌體克隆載體噬菌體載體單鏈噬菌體載體----M13雙鏈噬菌體載體----λ噬菌體cosmid克隆載體知識回顧思考題1、名詞解釋：基因克隆載體、遷移作用、接合質(zhì)粒、親和質(zhì)粒、顯性質(zhì)粒。2、任一DNA分子都可作為克隆載體使用嗎？為什么？3、構(gòu)建質(zhì)粒載體時需考慮哪些特性？講究何策略？遵循什么設(shè)計原則？4、指出pBR322的結(jié)構(gòu)來源，并圖示pBR322的構(gòu)建。5、簡述LacZ`的篩選機制。6、pUC質(zhì)粒的基本結(jié)構(gòu)組成。1、λDNA噬菌體中：線性宿主細胞：環(huán)狀(cos位點)cos位點知識回顧2、λ噬菌體的生長途徑有兩種，分別是：溶菌生長途徑

和

溶源生長途徑。3、在溶菌生長途徑中，λDNA的復制有兩種模型：

復制

和

滾環(huán)式復制

。知識回顧1、λ噬菌體是一種溫和噬菌體對大腸桿菌有很高的感染性，以原噬菌體的形式長期潛伏在溶原細胞里，容易保存。在一定條件下又可轉(zhuǎn)入溶菌生長途徑，進行大量繁殖。2、能承載較大的外源DNA片段 λDNA頭部可包裝約36.4～51kb(自身的75%～105%)，且約有20kbλDNA可缺失（生長非必需）3、在λDNA上有多種限制性內(nèi)切酶位點簡述λ噬菌體載體的構(gòu)建依據(jù)？知識回顧

由質(zhì)粒和含cos位點的λDNA片段組裝成的載體，即cosmid.3.2病毒（噬菌體）克隆載體二、cosmid克隆載體（柯斯質(zhì)粒載體）λDNA質(zhì)粒含cos位點和控制包裝的序列復制子抗藥性基因克隆位點（一）構(gòu)建策略?1、環(huán)形雙鏈DNA分子,

≤36.4kb,一般＜10kb2、具有質(zhì)粒的性質(zhì)，可轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并按質(zhì)粒方式復制（二）cosmid的特征3.2病毒（噬菌體）克隆載體3、含有一個cos位點A蛋白cos末端→體外包裝成為噬菌體，但不含λ噬菌體溶菌生長途徑、溶原生長途徑和DNA復制系統(tǒng)，不會產(chǎn)生子代噬菌體.4、cosmid較小，可承載更大的外源DNA 若cosmid為6.5kb，則可承載44.5(51-6.5)kb外源DNA，且能被包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒。

因此，cosmid克隆廣泛用于構(gòu)建基因組文庫。5、方便的選擇具有抗菌素抗性基因，以及插入失活的選擇標記、克隆位點。3.2病毒（噬菌體）克隆載體3.2病毒（噬菌體）克隆載體（三）理論依據(jù)利用Cosmid載體在大腸桿菌中克隆大片段的真核基因組DNA技術(shù)，叫“柯斯克隆”。（CosmidClone）cos位點：包裝識別。3.2病毒（噬菌體）克隆載體（四）一般過程3.2病毒（噬菌體）克隆載體3.2病毒（噬菌體）克隆載體（五）cosmid載體克隆的缺點解決措施3.2病毒（噬菌體）克隆載體3.2病毒（噬菌體）克隆載體cosmid克隆載體由于只有一個cos位點，必須先對cos位點進行處理，構(gòu)成具有兩個cos位點的二聯(lián)體線性的DNA分子。當外源的DNA分子插入二聯(lián)體分子，并且兩cos位點的片段大小合適（40kd）就可以被A蛋白切割產(chǎn)生兩個cos末端。絲狀噬菌體，內(nèi)有一環(huán)狀單鏈DNA分子（“+”鏈DNA） 大小：6.4kb

結(jié)構(gòu)：10個區(qū)基因間隔區(qū)507bp（intergenicregion，IG區(qū)）含復制起始位點及可插入外源DNA的位點三、M13噬菌體克隆載體（一）M13DNA3.2病毒（噬菌體）克隆載體三、M13噬菌體克隆載體（一）單鏈DNA噬菌體的特征(1)+DNA（ssDNA）.(2)復制型是雙鏈DNA為中間媒介。M13噬菌體感染雄性大腸桿菌后，M13的“+”DNA進入細胞，以此為模板復制“-”DNA,,由此產(chǎn)生的DNA為雙鏈DNA（RF-DNA）。RF-DNA一般按照環(huán)狀雙鏈DNA進行復制，同時按照“+”DNA轉(zhuǎn)譯出一些包裝蛋白。當RF-DNA達到一定數(shù)量時，“+”DNA被阻遏蛋白結(jié)合，阻斷“-”DNA復制合成。結(jié)果細胞只能以“-”DNA為模板合成新鏈“+”DNA，而新鏈“+”DNA被積累在細胞內(nèi)的殼蛋白包裝成噬菌體，不斷被擠出宿主細胞。3.2病毒（噬菌體）克隆載體3.2病毒（噬菌體）克隆載體（一）單鏈DNA噬菌體的特征3.2病毒（噬菌體）克隆載體（一）單鏈DNA噬菌體的特征（二）M13的生活周期3.2病毒（噬菌體）克隆載體三、M13噬菌體克隆載體+DNA轉(zhuǎn)錄mRNA翻譯形成噬菌體蛋白，-DNA合成+DNA。3.2病毒（噬菌體）克隆載體策略：在RF-DNA的IG區(qū)插入選擇標記基因，并組裝合適MCS。1.克隆區(qū)域的選定（2）酶切位點（1）基因間隔區(qū)（intergenicregion，IG區(qū)）該區(qū)域只有一個BsuI酶切位點，其余9個在其他部位。3.2病毒（噬菌體）克隆載體（三）M13噬菌體克隆載體的構(gòu)建策略和途徑三、M13噬菌體克隆載體含復制起始位點及可插入外源DNA的位點（不影響M13噬菌體活性）。3.2病毒（噬菌體）克隆載體（三）M13噬菌體克隆載體的構(gòu)建策略和途徑三、M13噬菌體克隆載體2.加入酶切位點（1）在IG區(qū)加入酶切位點在IG區(qū)內(nèi)插入大腸桿菌的LacZ序列（a-肽序列）。利用a-肽序列的三個單一酶切位點（BglII、AvaII和PvuI）3.2病毒（噬菌體）克隆載體（三）M13噬菌體克隆載體的構(gòu)建策略和途徑三、M13噬菌體克隆載體3.2病毒（噬菌體）克隆載體（三）M13噬菌體克隆載體的構(gòu)建策略和途徑優(yōu)點：1、以雙鏈環(huán)形DNA為中間媒介復制，可與質(zhì)粒一樣體外純化操作。2、制備的M13DNA單、雙鏈都能轉(zhuǎn)染大腸桿菌受體細胞。3、單鏈DNA不受包裝限制，可包裝M13DNA分子6倍的DNA分子。4、可產(chǎn)生大量純化的含外源DNA插入的單鏈DNA分子。（四）M13克隆載體的優(yōu)點與應用3.2病毒（噬菌體）克隆載體三、M13噬菌體克隆載體主要用途：

克隆、分離單鏈外源DNA片段,獲得的“+”鏈可直接用于DNA測序3.2病毒（噬菌體）克隆載體（四）M13克隆載體的優(yōu)點與應用花椰菜花葉病病毒（CaMV）

環(huán)狀雙鏈DNA分子（一）CaMV

DNA分子 大小：8kb

結(jié)構(gòu)：在病毒顆粒中呈開環(huán)形式，負鏈有一缺口，正鏈有兩缺口。進入植物細胞后單鏈部分被酶解，缺口自行閉合，成為環(huán)狀DNA分子。3.2病毒（噬菌體）克隆載體四、CaMV克隆載體G1G2G3（二）CaMV基因區(qū)8個閱讀框（ORF）和3個間隔區(qū)（IR1～3）

IR1－ORFVI與ORFVII之間

IR2－ORFVII與ORFI之間

IR3－ORFV與ORFVI之間

IR1和IR3區(qū)各有一個啟動子結(jié)構(gòu)，分別啟動同方向轉(zhuǎn)錄35SRNA和19SRNA，而兩者的終止子都在IR1區(qū)。

35S啟動子——組成型強啟動子。組裝了35S啟動子的外源基因可在植物細胞高效表達，在藍藻細胞內(nèi)也有效表達。（三）CaMV的增殖和感染

1、增殖途徑：

CaMV顆粒→蚜蟲→病毒DNA進入植物細胞核→ 轉(zhuǎn)錄19SRNA→翻譯

35SRNA→翻譯反轉(zhuǎn)錄“-”鏈DNA→復制出“+”鏈2、CaMV-DNA可轉(zhuǎn)染植物細胞 在ORFII和ORFVII區(qū)插入外源DNA后仍能轉(zhuǎn)染植物細胞包裝成新的CaMV顆粒（四）構(gòu)建CaMV克隆載體的基本策略和途徑策略：

CaMV-DNA能侵入植物細胞而將目的基因?qū)耄⑶仪宄鼵aMV對植物的致病性基因.途徑1、構(gòu)建互補克隆載體。組裝(目的基因+標記基因)而無感染能力+兩種基因和感染能力都無→彼此獲得對方產(chǎn)物→感染能力。很少被采用。2、構(gòu)建置換型克隆載體。置換的外源基因較小3、構(gòu)建混合型克隆載體。

CaMV-DNA→合適的限制性酶切→組入Ti的T-DNA區(qū)→完成構(gòu)建4、構(gòu)建CaMV-融合基因克隆載體系統(tǒng)。 將35S啟動子與目的基因融合，高效表達目的基因。