細菌crisprcas免疫機制研究進展

大多數(shù)生物利用ra指南來保護自己的免受外源基因?qū)ψ陨砣郝浜蜕憝h(huán)境的破壞，例如真核生物的鈉干擾。通過對大量的真細菌以及古細菌的基因組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn):已測序的將近40%的真細菌以及幾乎所有古細菌的基因組內(nèi)都包含有多種非自身基因,這些基因成簇存在,并且被短的重復(fù)回文序列(CRISPR)所分割,這些間隔序列與重復(fù)序列一起構(gòu)成了細菌基因組的CRISPR位點。在研究中發(fā)現(xiàn),含有非自身基因的細菌及古細菌具有免疫記憶功能,可以特異性地抵抗噬菌體以及侵襲性質(zhì)粒的二次感染。1細菌crisp-cas免疫1.1rna的干擾細菌的這種抗感染機制是通過類RNA干擾(RNAi)實現(xiàn)的。通過包含特異性間隔序列的小RNA片段(crRNA)作用于具有互補核酸序列的入侵噬菌體或質(zhì)粒的基因,破壞入侵的基因序列,特異性地抵抗感染。crRNA的干擾不被噬菌體的防御系統(tǒng)所限制,可以抑制外源基因?qū)ψ陨砘蚪M的破壞,從而保持自身基因組的完整性。RNAi與crRNAs介導(dǎo)的免疫最主要的區(qū)別在于酶種類不同。并且在RNAi中,核心雙鏈RNA的長度為21~28個核苷酸長度;crRNAs由間隔序列以及部分重復(fù)序列組成,只間隔序列就有23~47個核苷酸長度。真細菌以及古細菌的這種獲得性免疫與基因的水平轉(zhuǎn)移、類RNA干擾機制以及前體crRNA(pre-crRNA)的體內(nèi)切割密切相關(guān)。在這些過程中牽涉到新的間隔基因的獲得、整合,pre-crRNA的切割,自身CRISPR位點的更新。這與CRISPR相關(guān)基因(cas)以及體內(nèi)的一些其他因子密切相關(guān)。1.2crispr位點的基因序列分析肺炎雙球菌毒力因子之間的轉(zhuǎn)化試驗揭開了人類對于基因水平轉(zhuǎn)移認識的序幕。基因的水平轉(zhuǎn)移是指通過質(zhì)粒、病毒以及轉(zhuǎn)位因子等的轉(zhuǎn)染而獲得非自身基因的過程。基因的水平轉(zhuǎn)移、突變以及快速的繁殖實現(xiàn)了細菌基因組的多樣性。基因的水平轉(zhuǎn)移可以使細菌獲得多個母本菌的突變,如:抗生素抗性基因(β-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷修飾酶)等有益突變,但是轉(zhuǎn)位基因插入基因組的位置以及基因本身有時表現(xiàn)出對細菌的毒害作用,從而導(dǎo)致細菌的死亡。所以有益突變得以在菌群中傳播,而毒害基因伴隨著細菌的死亡而消失。通過細菌的基因組分析認為,存在于40%真細菌以及幾乎所有古細菌的CRISPR位點中的間隔序列是通過基因的水平轉(zhuǎn)移獲得的。主要是通過整合病毒或者質(zhì)粒DNA的基因序列到CRISPR位點,從而獲得新的間隔序列。同時,由于這些基因的存在使得菌體免受噬菌體及侵襲性質(zhì)粒對自身遺傳物質(zhì)的破壞,并且CRISPR位點的存在不會對細菌本身造成傷害,所以這些有益突變得以在菌體中穩(wěn)定存在。CRISPR位點的第一個重復(fù)序列的上游定位有CRISPR前導(dǎo)序列(leadersequence),啟動子可能位于前導(dǎo)序列內(nèi)。CRISPR位點其他部分進行一次性全長轉(zhuǎn)錄,然后在cas蛋白以及其他因子的參與下,將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物切割為多種不同的crRNA片段,每個crRNA片段包括特異性的間隔序列以及重復(fù)序列片段。crRNA中的特異性間隔序列作為有效靶向性RNA,與入侵核酸結(jié)合,導(dǎo)致入侵核酸被降解;在間隔序列上帶有一定長度的重復(fù)序列片段,在免疫識別方面具有重要的作用。2pr的亞型及基因序列cas基因特異性存在于含有CRISPR位點的菌體基因組中,定位在CRISPR位點附近,它是一個較大的多態(tài)性家族,具有多種亞型。CRISPR的亞型是由CRISPR的重復(fù)序列、前導(dǎo)序列以及cas基因共同決定的,并且三者之間存在著共進化現(xiàn)象。根據(jù)cas基因在CRISPR位點的存在情況,可以分為三類:核心基因、亞型特異性基因以及RAMP(repeat-associatedmysteriousprotein)超家族。cas基因編碼的蛋白質(zhì)是一個大的蛋白質(zhì)家族,這些蛋白質(zhì)分別攜帶有典型的核酸酶、解旋酶、聚合酶以及多核苷酸結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域。2.1cas1基因編碼的基因功能核心基因目前已鑒定出六種:cas1、2、3、4、5、6。核心cas基因并不存在于所有的具有CRISPR位點的細菌中,但是這些基因在所有的CRISPR亞型中都有分布。核心基因最常見的排列方式是cas3-cas4-cas1-cas2。cas1、cas2是最基本的成員,存在于所有含有CRISPR位點的細菌中。各種核心cas基因編碼的蛋白的功能已經(jīng)基本得到驗證。Cas1具有核酸結(jié)合蛋白活性以及核酸內(nèi)切酶活性,可以利用DNA酶活性裂解入侵的DNA以及CRISPR位點,最終將入侵序列整合到CRISPR位點。Cas2被認為是一種序列特異性的內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶,切割富含U的單鏈RNA。Cas3是一種DNA酶,并且同時是一種依賴于ATP的解旋酶,Cas3的ATP依賴性解旋酶被認為是一種動力蛋白,協(xié)助核酸酶活性實現(xiàn)對CRISPR相關(guān)抗病毒(cascade)-crRNA復(fù)合物上DNA的切割。Cas4類似于核酸外切酶的RecB家族,并且包含有一個富含Cys的結(jié)構(gòu)域,具有結(jié)合DNA的功能。Cas5蛋白包含一個保守的N-末端區(qū)域,但是C-末端在不同的CRISPR/cas亞型中是不同的,它們的平均長度是250個氨基酸。Cas6是一種核酸內(nèi)切酶,將前體crRNA切割為crRNA單元(在5′端包括一個8核苷酸的重復(fù)序列),Cas6突變證明,Tyr31、His46可能是一種切割重復(fù)RNA的常規(guī)單元,Lys52可能用于維持轉(zhuǎn)換狀態(tài)。2.2通過pse3的鐵氧化還原蛋白亞型特異性基因類型有:cse(1~4、5e)、csy(1~4)、csn(1~2)、csd(1~2)cas5d、cst(1~2)、cas5t、csh(1~2)、cas5h、csa(1~5)、cas5a、csm(1~5)。這些基因大部分參與pre-crRNA的切割,其中少部分基因的結(jié)構(gòu)與功能已經(jīng)被證實:csn2(Cas7)可能參與到新間隔序列的識別及整合;Cse3上存在一個鐵氧化還原蛋白樣的折疊,總體結(jié)構(gòu)與許多的RNA結(jié)合蛋白相似。它對于pre-crRNA的成熟切割來說是必需的;Csy4可以通過活性位點上保守的絲氨酸以及組氨酸活性位點有選擇性地結(jié)合pre-cRNA,并且進行切割產(chǎn)生成熟的crRNAs;Csa3的N-端結(jié)構(gòu)域功能目前尚未確定,但是被認為具有調(diào)節(jié)CRISPR/cas的功能。RAMP超家族基因包括:cmr(1~6)、csx(1~7)。目前,該家族的基因功能尚不明確。這些Cas蛋白作為一個功能集合體,主要功能是維護CRISPR位點的重復(fù)序列、獲得新的間隔序列、保證前導(dǎo)區(qū)域及重復(fù)區(qū)域在基因組中的擴增以及CRISPR/cas基因的水平轉(zhuǎn)移。大腸桿菌K12菌株中,pre-crRNA與Cse1-Cse2-Cse4-Cas5e-Cse3形成的Cascade復(fù)合物結(jié)合,Cse3的功能是將pre-crRNA切割加工成crRNA。同時,Cas在菌種間甚至是菌株之間存在著明顯,一些個體在一個CRISPR位點有20種Cas,而一些只有4種,這在很大程度上決定了細菌獲得性免疫的多樣性。3rna酶csrena,cs1從大腸桿菌、銅綠假單胞菌以及古細菌焦酚火球菌純化的Cas蛋白可以切割pre-crRNA形成成熟的crRNAs。因此,特異性的Cas蛋白對于菌體中的RNA切割來說是必須、高效的。多Cas復(fù)合體可以完成pre-crRNA的切割,但是對于一些CRISPR亞型,其Cas種類較少,比如:TypeⅡ(Nmeni/CASS4)亞型系統(tǒng)缺少cse3、cas6或者是csy4,無法形成具有活性的切割復(fù)合物。化膿鏈球菌只有四種Cas,但是Deltcheva等證實化膿鏈球菌可以利用RNA酶Ⅲ處理CRISPR位點轉(zhuǎn)錄的pre-crRNA。RNA酶Ⅲ是一種保守的內(nèi)源性核酸酶,可以切割雙鏈RNA并且參與核糖體RNA的成熟。反義RNA(tracrRNA)在RNA酶Ⅲ參與的前體RNA的切割中有著重要的作用。tracrRNA是一些冗余的短RNA,包括CRISPR重復(fù)序列的互補區(qū)域。在體外,tracrRNA可以與pre-crRNA發(fā)生退火,成為雙鏈RNA,為RNA酶Ⅲ提供模板。在體內(nèi),RNA酶Ⅲ對前RNA的切割需要Csn1的參與。Csn1是CRISPR家族的特異性Cas蛋白質(zhì)之一,它的特點是單拷貝重復(fù)(有時是直接的,有時是顛倒的),出現(xiàn)在CRISPR位點第一個基因的上游。在嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)中,Csn1不是crRNA介導(dǎo)免疫的必要組成成分。Csn1通過分子錨定作用促進tracrRNA與pre-crRNA的堿基配對,為隨后RNA酶Ⅲ對pre-crRNA的識別以及切割提供條件;同時Csn1可能有助于保護tracrRNA以及pre-crRNA免受其他RNA酶的切割。tracrRNA對于處理pre-crRNA成為活性的crRNAs是一種被TypeⅡ(Nmeni/CASS4)cas亞型所共有的RNA成熟機制。但是,是否所有的TypeⅡCRISPR位點都需要RNA酶Ⅲ的參與,需要進一步驗證。總體說來,tracrRNA介導(dǎo)的pre-crRNA的切割賦予細菌一種新的crRNA成熟策略,對免疫方式的多樣性以及CRISPR位點復(fù)雜的分子機理提供了新的解釋。4crispr堿基配的結(jié)構(gòu)免疫系統(tǒng)必須能夠區(qū)別自身與非自身,以免引起自身免疫疾病。動物的后天性免疫系統(tǒng)中,T、B淋巴細胞經(jīng)過陰性選擇來保證對自身成分的免疫耐受,而不發(fā)生免疫攻擊。crRNAs是從CRISPR位點轉(zhuǎn)錄切割而得到的,具有結(jié)合CRISPR位點的能力。因此,對于真細菌以及古細菌crRNAs介導(dǎo)的獲得性免疫,必須有一種機制來區(qū)分自身與非自身的核酸成分,以確保crRNAs不會進攻細菌自身的基因組成分造成菌體的死亡。通過構(gòu)建表皮葡萄球菌(S.epidermidis)CRISPR位點的間隔重復(fù)序列以及這個序列上游以及下游的各200個堿基對的pC194重組質(zhì)粒pCRISPR(wt),然后轉(zhuǎn)染野生型以及CRISPR缺失型細胞。試驗結(jié)果表明,crRNA的冗余序列(非間隔序列成分)與重復(fù)序列的堿基配對失配,可以導(dǎo)致crRNA干擾細菌自身基因組。通過對-5到-2位的堿基突變說明:保護細菌基因組免受crRNA的干擾破壞,必須保證最低限度的-4、-3、-2位的配對。同時,-4到-2位點的2個連續(xù)的堿基缺失或者是突變對于crRNA的干擾發(fā)生是必需的。-5到-2位點的堿基區(qū)域的對于保護細菌自身的CRISPR位點來說是一個關(guān)鍵區(qū)域。crRNA和CRISPRDNA重復(fù)之間的堿基配對阻止了自身免疫的發(fā)生。CRISPR通過crRNAs的潛在堿基配對,不僅僅是一個配對的特異性靶點,同時還有是間隔序列的外部序列。間隔序列外的差異性配對在所有的CRISPR系統(tǒng)中都存在,表明這種機理是所有免疫路徑面對自身免疫與非自身免疫時的普遍運用的機理。cas基因表現(xiàn)出高度多樣性。因此,不同的CRISPR/cas亞型存在不同的機理。CRISPR的間隔序列之間的堿基序列是不同的,但是間隔區(qū)域之外的重復(fù)序列對于特定的菌體來說是固有的。因此,這種區(qū)別異己的機理可以廣泛的運用到細菌的獲得性免疫中。對于干擾發(fā)生來說,沒有特異性的堿基配對要求,導(dǎo)致干擾發(fā)生的決定性因素是crRNA與CRISPRDNA的堿基配對失敗。5新的毒力因子水平轉(zhuǎn)移技術(shù)crRNA介導(dǎo)的干擾免疫可以干擾噬菌體以及侵襲性質(zhì)粒的