觀賞植物花色基因工程研究進展

顏色是植物的一個重要品質特征。狹義的顏色指的是花瓣的顏色。一般來說，花朵、雄蕊和菖蒲也可以用作花瓣（程金潮，2000）。花色的優劣直接關系到觀賞植物的觀賞價值和商業價值,特別是近年來隨著經濟的快速發展,人們對花卉的需求也日益增加,那些具有新奇花色的觀賞植物具有廣闊的市場前景。自然界花卉顏色種類繁多,但是一些重要花卉的色系卻有限,如月季、香石竹、郁金香、菊花等缺乏藍色和紫色,天竺葵、仙客來、非洲紫羅蘭、翠菊等缺乏黃色,球根鳶尾、紫羅蘭等缺乏猩紅色或磚紅色,因此花色改良一直是育種工作者追逐的重要目標。然而花色在生化和遺傳上都極為復雜,傳統育種技術在花色育種上就顯得力不從心。蓬勃發展的基因工程為觀賞植物花色的基礎研究和品種選育帶來新的思路和途徑。它可以導入控制某種(些)性狀的基因而擴大其基因庫,可以定向修飾觀賞植物的某個(些)性狀而不改變其原有性狀,因此可在保持原有性狀的基礎上,改變觀賞植物的花色,甚至創造該物種所不具有的花色,在較短時期內培育出穩定遺傳的新品種、新類型。觀賞植物花色基因工程較之其他作物基因工程有諸多優點,首先由于花色素的明顯可見性,遺傳操作的檢測簡易;其次因其用作觀賞而非食用,因此安全性考慮較少;此外花色基因工程孕育著巨大的經濟效益。因此它一方面是研究基因表達、調控和互作的熱點課題,另一方面又逐漸成為許多生物工程公司培育新奇花卉品種、創造經濟效益的重點產業。近年來花色基因工程已取得了矚目的進展。1類黃酮copogmen花色是光線照射到花瓣上穿透色素層時,部分被吸收,部分被海綿組織反射折回,再度通過色素層而進入我們眼簾所產生的色彩。因此它與花瓣細胞中的色素種類、色素含量(包括多種色素的相對含量)、花瓣內部或表面構造引起的物理性狀等多種因素有關,但花色素起主要作用。與花成色有關的色素包括葉綠素、類胡蘿卜素、類黃酮、水溶性生物堿及其衍生物四大類群,其中水溶性的類黃酮可產生從淺黃到藍紫的全部顏色范圍(鄭志亮,1996)。花的成色作用還受以下因素的影響:①細胞內pH值:花瓣表皮細胞液泡pH值發生變化,常引起花色的改變,通常隨著pH值上升,顏色逐漸由紅變藍(鄭志亮,1996;邱輝龍和范明任,1998)。②分子堆積作用(molecularstacking):包括分子間堆積和分子內堆積,分子間堆積包括花色苷的自連作用(self_association)和輔助著色作用(co_pigmentation),即花色苷與輔助色素(copigment)結合而呈現增色效應(hyperchromiceffect)及紅移(bathochromicshift),從而產生從紫到藍色色系的現象,這種現象在pH1～7的范圍內都可能發生,其產物對pH值的微小改變極其敏感(邱輝龍和范明任,1998;Tanakaetal,1998)。③螯合作用:色素常與細胞液中的Mg、Fe、Al、Mo等金屬離子螯合,螯合后花色在一定程度上有所改變,往往偏向紫色(鄭志亮,1996)。④花瓣表皮細胞的形狀:細胞形狀有利于增加細胞對入射光吸收的花,產生較深的色澤;反之,則產生明亮的外觀(邱輝龍和范明任,1998)。2香石竹dfr、anas的結構及分類四大類色素都為次生代謝物,其合成涉及多個代謝步驟,由多種酶催化,因而與之相關的結構基因及調節基因也較多,它們的作用機理十分復雜。目前對植物中普遍存在的花色苷的合成途徑以及與之相關的基因研究較為深入(Tanakaetal,1998)。花色苷合成的第一種關鍵酶是苯基苯乙烯酮(又稱查爾酮)合酶(chalconesynthase,CHS),它與某些縮合酶(condensingenzyme)具有同源性,如擬南芥的FAE1和酮酯酰基(ketoacyl_acyl)載體蛋白合酶。黃烷酮_3_羥化酶(flavanone3_hydroxylase,F3H)是一種酮戊二酸依賴性的過氧化物酶,催化二氫黃烷酮(naringenin)生成二氫堪非醇(dihydrokaempferol,DHK,又稱二氫黃酮醇,dihydroflavonol)。類黃酮_3′_羥化酶(flavonoid3′_hydroxylase,F3′H)和類黃酮_3′,5′_羥化酶(flavonoid3′,5′_hydroxylase,F3′5′H)屬于同一細胞色素P450家族,它們決定二氫堪非醇B環的羥化模式,并最終決定產生花色的花色苷結構,F3′5′H是合成藍色的花翠素_3_葡萄糖苷的關鍵酶。二氫黃酮醇還原酶(dihydroflavonol4_reductase,DFR)是催化DHK、DHQ(二氫櫟皮黃酮)、DHM(二氫楊梅黃酮)分別形成無色花葵素、花青素、花翠素的關鍵酶,它可能屬于3β_羥基甾體脫氫酶或DFR超家族。不同來源的DFR對三種底物的親和性有所差異,如矮牽牛DFR主要催化DHM,其次是DHQ,而對DHK則無作用(吳少華和張大生,2002)。Jonson等(2001)鑒定了DFR與底物專一性結合有關的區域,并通過改變該區域的一個氨基酸使DFR優先催化DHK。無色花色素在花色素合酶(anthocyanidinsynthase,ANS)催化下產生有色花色素。DFR、ANS與花色的產生直接相關,香石竹DFR、ANS基因的轉錄水平隨著花色從粉至紅顏色加深而提高(Matoetal,2001)。類黃酮_3_O_糖基轉移酶(flavonoid3_O_glycosyltransferase3GT)催化花色素的糖苷化,但在矮牽牛中發現一種不同于其他3GT的黃酮醇_3_O_半乳糖基轉移酶(flavonol3_O_galactosyltransferase,F3GalTase),其僅存在于花粉,催化發芽所需的黃酮醇的糖苷化(Milleretal,2002)。3色彩育種手術3.1顏色基因的類型與克隆3.1.1類黃酮合成基因花色基因包括花色素基因、花色素量基因、花色素分布基因、輔助色素基因、轉座子基因、控制花瓣內部酸度的基因等。Forkmann(1991)將這些花色基因分為以下幾類:①控制類黃酮生物合成單個步驟的基因;②與類黃酮修飾有關的基因;③開關全部或部分合成途徑的調節基因;④影響類黃酮濃度的基因;⑤與花朵結構有關的基因;⑥影響花色的基因或因子;⑦控制花瓣毛、乳突、色素細胞的形狀和分布、角質層類型等形態特征的基因。3.1.2花色苷調節基因花色基因工程的第一步是花色苷生物合成途徑結構基因的克隆。目前,利用轉座子標簽、PCR、蛋白質純化與差異篩選等方法,已分離、克隆了多種花色苷結構基因。矮牽牛編碼F3′5′H的基因Hf1和Hf2的表達均能使花色苷生物合成途徑趨向于產生藍色的花翠素_3_葡萄糖苷,從而使花趨于顯藍色。澳大利亞Florigene公司和日本Sandory公司的研究人員將矮牽牛F3′5′H和DFR基因導入缺乏DFR的白色香石竹,培育出紫色品種‘Moondust’,現已在兩個國家銷售,成為第一例上市的轉基因花卉作物(Meyeretal,1987)。調節基因影響著結構基因的表達方式和表達強度,花色苷生物合成的每一步酶促反應均是調節基因作用的靶位點。利用轉座子標簽等技術現已分離出兩類花色苷調節基因:一類是myc型轉錄因子,如玉米的R基因家族(R、S、Sn、Lc基因)和金魚草Delila基因;另一類是myb型轉錄因子,如玉米的C1、Pl、P、Vp1基因(包滿珠,1997;余迪求和李寶健,1997)。Goff等認為這兩類轉錄因子相互作用激活結構基因的表達。不同植物的花色苷合成調節基因在功能上具有保守性,其中某些調節基因可在外源物種中發揮調節作用。將玉米Lc基因導入煙草,引起其花色由粉紅變為深紅。玉米B_Peru基因(myc型)轉入白三葉(Trifoliumrepenscv.Haifa)引起其葉片著色方式的改變,且這種變化可穩定遺傳(Majniketal,2000)。隨著花色研究的深入,逐步明確了其他與花成色有關的基因功能,并克隆了其中一部分基因。部分已分離的花色基因如表1。3.2生物酶制劑的使用因為花色往往由多個代謝步驟、多基因決定,所以利用基因工程技術修飾這一性狀的一個重要策略是還原法(reductionapproach),即欲修飾某個性狀時,首先要明確決定該性狀的特異生化物質,然后對形成該生化物質的代謝途徑進行基因工程操作,具體就是分析催化各反應步驟的酶、編碼這些酶的基因及其表達調控(傅榮昭,1995)。多步驟的代謝途徑有限速步驟,而限速步驟對整個代謝途徑起著決定性作用,所以對限速步驟的遺傳操作往往是還原法的重要突破口。增強某種關鍵酶的表達,往往可使花色苷合成途徑朝生成其催化產物的方向進行,而抑制該酶的表達,則會使反應朝合成途徑的另一分支進行,導致另一種產物的積累。因此增強F3′5′H、DFR的表達分別是培育藍花和磚紅色花品種的一個切入點。3.3色彩檢測的方法3.3.1chs基因突變植株利用基因工程技術進行花色修飾的常用方法是反義抑制法(或稱反義RNA法,AntisenseSuppression),即首先明確決定花色的特異生化物質,然后分析該生化物質代謝途徑中催化各反應步驟的酶,克隆編碼這些酶的基因,反向轉入到目的植株中,外源DNA轉錄產物與內源的互補mRNA結合,從而抑制目的植株中這些生化物質的合成,產生花色突變(何小玲和王金發,1998)。利用該技術已在矮牽牛(Vanetal,1988)、菊花(Guttersonetal,1994)等幾種觀賞植物中進行了成功的花色修飾。1988年VanderKrol等首次將反義CHS基因導入矮牽牛中,可抑制花色苷的形成,引起花色改變。反義CHS基因導入非洲菊,導致花瓣著色異常(Elomaaetal,1993)。Gutterson等通過根癌農桿菌介導轉化法,將一個從菊花中分離到的CHS基因,以反義和正義方向分別導入開粉紅色花的菊花中,獲得開淺紅色和白色花的轉基因植株,對照組沒有白色花,進一步研究表明,轉基因植株的開白花性狀通過營養繁殖絕大多數能穩定遺傳。Aida等(2000)用相同的方法將CHS或DFR基因導入藍豬耳(Toreniahybrida),結果反義方向導入的轉化株花色均一變亮,而正義方向導入的轉化株花色不均一變亮。目前反義RNA技術的機理尚未明了,可能是作用于基因的轉錄、翻譯水平。3.3.2．有利于抑制內源基因的表達共抑制法(cosuppression),又稱有義抑制法(sensesuppression),即正向導入一個(或幾個)內源基因的額外拷貝,反而抑制該內源基因轉錄產物mRNA的積累,進而抑制該內源基因的表達(Napolietal,1990;Rjorgensenetal,1995)。該技術在矮牽牛(傅榮昭,1995)、菊花(Guttersonetal,1994)、藍豬耳(Suzukietal,2000)等花卉的花色修飾方面已取得成功。共抑制引起花色多樣性的分子機制尚不清楚,初步分析認為,同源順序的存在可能是產生共抑制效應的基礎,它與反義RNA的作用機制可能有某些共同之處,即都存在基因互作效應(洪孟民,1994)。3.3.3矮牽牛花開磚紅色花即將欲修飾的供試株及其近緣種植物中原先不具有的一個(或幾個)基因導入其中,從而使該受體植物增加一個(或幾個)新的性狀。Meyer等(1987)首次將源自玉米的編碼DQR的A1基因導入矮牽牛白花突變體中,產生了開磚紅色花的矮牽牛。薔薇缺乏編碼合成藍色色素——花翠素的關鍵酶F3′5′H的基因,1992年,澳大利亞CalgenePacific公司與日本Sundory公司合作向薔薇中導入該基因獲得成功,同年該公司在矮牽牛中導入該基因獲得藍色矮牽牛(蘇煥然等,1996)。3.3.4花的調節基因此外,在花色基因工程操作中,也可以導入調節基因以增強或減弱原有代謝產物表達,或導入其他與花成色作用有關的基因,如ph基因、輔助色素基因、細胞形狀基因等,也可以同時導入與某種花色有關的多種基因。Quattrocchio等(1993)將一系列花色苷合成的調節基因導入矮牽牛,獲得粉色花。Kim(2001)將玉米C1基因通過農桿菌介導轉化煙草,轉化株花瓣變狹長,顏色顯著變淺。多基因同時導入對培育藍色月季具有重要利用價值,因為藍色月季須具備三個條件:花翠素、輔助色素黃酮醇、較高的pH值,目前Suntory公司和CalgenePacific公司等正在進行這項工作。4我國觀賞植物結構基因研究的現狀21世紀花卉業競爭是品種和技術的競爭,掌握豐富的資源和先進的技術,勢必會在競爭中處于主動地位。近十年來,花卉基因工程的發展正日益加快,很有可能給花卉業帶來革命性的影響。花卉業發展水平較高的發達國家早已意識到要占領國際市場就必須不斷地培育出更新穎、更美麗的花卉品種,觀賞植物的基因工程為此帶來希望和契機。發達國家已在觀賞植物的花色基因工程上開展了大量的基礎和應用研究,并取得了有效的成績,具備明顯的競爭優勢。我國在