遺傳學實驗：實驗十 目的基因的克隆與鑒定_第1頁
遺傳學實驗：實驗十 目的基因的克隆與鑒定_第2頁
遺傳學實驗：實驗十 目的基因的克隆與鑒定_第3頁
遺傳學實驗：實驗十 目的基因的克隆與鑒定_第4頁
遺傳學實驗：實驗十 目的基因的克隆與鑒定_第5頁
已閱讀5頁，還剩5頁未讀， 繼續免費閱讀

下載本文檔

版權說明：本文檔由用戶提供并上傳，收益歸屬內容提供方，若內容存在侵權，請進行舉報或認領

文檔簡介

四、實驗步驟1連接：pMD18-T載體（Takara試劑盒）pMD18-T

Vector

1ulDNA4ulSolutionI5ul10ul加樣16℃30min2轉化:

全量(10ul)加入50ul感受態細胞中，冰上放置30min42℃90秒，冰上放置2min加入400ulLB培養基，37℃震蕩培養60min3培養鑒定:

10000轉，離心2min，取200ul上清丟棄，其余混勻。取50ul涂板（IPTG,X-Gal,氨芐），37℃10-15小時觀察，白色菌斑為重組型。實驗十目的基因的克隆與鑒定實驗十、目的基因的克隆與鑒定一、實驗目的掌握目的基因片段連接、質粒轉化、菌落培養鑒定方法。為基因測序和其它研究和應用準備高質量的基因片段。連接:回收目的基因片段同克隆載體連接轉化:將重組載體導入細菌篩選:通過抗性基因和顯色反應選擇重組載體回收:在細菌中大量繁殖重組載體并回收鑒定:菌落和重組載體是否含目的基因片段實驗流程二、實驗原理1、連接Taq酶能夠在PCR產物的3’末端加上一個非模板依賴的A；T載體是一種帶有3’T突出端的載體；在連接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR產物直接插入到質粒載體的多克隆位點（MCS）中。

高效克隆PCR產物（TACloning）的專用載體2、轉化細胞經過一些特殊方法如電擊法,化學試劑法（CaCl2)等的處理后,細胞膜的通透性發生了暫時性的改變，成為能允許外源DNA分子進入的感受態細胞。3、鑒定--

α-互補質粒載體帶有一個大腸桿菌的DNA的短區段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區中插入了一個多克隆位點（MCS），它并不破壞讀框，但可使少數幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能。宿主細胞存在可編碼β-半乳糖苷酶C端部分的序列。它們同時存在時，能恢復lacZ酶的活性，稱為α-互補。在誘導劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時產生藍色菌落，因而易于識別。當外源DNA插入到質粒的多克隆位點后，幾乎不可避免地導致無α-互補能力的氨基端片段，使得帶有重組質粒的細菌形成白色菌落。三、實驗材料1連接：

基因：菠菜actin基因的部分序列（純化的PCR產物）

載體：pMD18-T載體。（Takara試劑盒）2轉化

重組質粒（上步結果）

感受態細胞DH5α（天根生物）

液體SOC培養基（或LB培養基）3鑒定LB固體培養基（IPTG,X-Gal,氨芐）

四、實驗步驟1連接：pMD18-T載體（Takara試劑盒）pMD18-T

Vector

1ulDNA4ulSolutionI5ul10ul加樣16℃30min2轉化:

全量(10ul)加入50ul感受態細胞中，冰上放置30min42℃90秒，冰上放置2min加入400ulLB培養基，37℃震蕩培養60min3培養鑒定:

10000轉，離心2min，取200ul上清丟棄，其余混勻。取50ul涂板（IPTG,X-Gal,氨芐），37℃

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明，都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等，如果需要附件，請聯系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙，網頁內容里面會有圖紙預覽，若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業或盈利用途。
  • 5. 人人文庫網僅提供信息存儲空間，僅對用戶上傳內容的表現方式做保護處理，對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯，并不能對任何下載內容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容，請與我們聯系，我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論