SPIO標記人胚胎干細胞皮下注射小鼠的示蹤研究【摘要】目的：探討超順磁性氧化鐵微粒（SPIO）體外標記人胚胎干細胞（ESC）及體內示蹤皮下注射裸鼠的人胚胎干細胞的能力。方法：使用硫酸魚精蛋白-SPIO共培養方式標記人胚胎干細胞。采用顯微鏡觀察干細胞標記情況，并進行富集純化，將經過SPIO標記的干細胞皮下注射裸鼠體內，應用1．5TMRI系統進行磁標記干細胞成像。結果：初步標記后的人胚胎干細胞用顯微鏡觀察，SPIO標記的干細胞細胞胞質內出現細小的黑色鐵顆粒，標記效率為90％；標記了SPIO的人胚胎干細胞體內MRI成像時顯示，細胞移植區域T2信號減弱。結論：SPIO能成功地標記ESC，SPIO標記的ESC皮下注射入小鼠體內的分布、遷移過程可用MRI進行檢測評價。【關鍵詞】干細胞移植；示蹤；超順磁性氧化鐵；磁共振成像；標記近些年來，胚胎干細胞的研究一直是生物醫學工程學中的熱點。胚胎干(embryonicstem,ES)細胞因具有全能性和無限增殖的能力而有望成為組織工程中種子細胞的新來源[1]。但是,ESC目前尚不能真正應用于臨床治療,還有許多問題亟待解決。其中,較為突出的是如何對移植的干細胞進行長期的、無創傷的實時檢測,從而了解其在體內的分布、遷徙、分化和轉歸等生物學行為。本實驗用SPIO標記人的胚胎干細胞，并通過皮下注射小鼠體，用MRI檢測其增殖分化特性。核磁共振成像(MagneticResonanceImaging，MRI)是分子影像學的一種技術，增加了本實驗過程細胞移植的無創活體示蹤的可行性。根據成像方法不同，分子成像主要包括核素分子成像、磁共振(magneticresonance,MR)分子成像、光學分子成像等。因MR成像具有無放射性,有較高的軟組織分辨能力和良好的重復性而倍受推崇[2]。超順磁性氧化鐵微粒(superparamgneticironoxides，SPIO)為一種納米分子探針，具有因良好的生物相容性和磁共振信號敏感性而被應用于該實驗中。細胞通過吞噬、吞飲等方式將納米粒子內吞于細胞體內，而對不具有吞噬能力或吞噬能力較弱的細胞,由于標記率低而不能直接將此類造影劑用于細胞的標記。磁性納米粒子表面修飾被認為是磁性納米粒子與細胞膜表面非特異性相互作用的關鍵因素,影響細胞標記率[1]，并且磁性粒子的粒徑影響磁共振靈敏度，磁性納米簇與單個納米粒子相比能顯著增強MRI信號[2-4]。本研究選擇微米級超順磁氧化鐵顆粒(SPIO)標記小鼠胚胎干細胞(ESC)及其分化的心肌細胞并行MR顯像，以檢測標記的有效性和對細胞生物學活性影響。1材料與方法1．1材料裸鼠、硫酸魚精蛋白、SPIO、1．5TMRI1．2方法1．2．1混合液的配制1.先稱取10mg的硫酸魚精蛋白溶于10ml的蒸餾水中；2.用槍吸取0.3ml的SPIO溶于20ml的無血清的培養基中；3.取1中已配制的溶液100ul加入2中溶液中，使硫酸魚精蛋白濃度為5ug/ml；4.往3中的溶液加入等體積的雙倍血清培養基，使最終SPIO的濃度為50ugFe/ml,即所需溶液。1．2．2干細胞的體外標記及富集6天之后，兩種細胞長到大約整個瓶壁的60%，即用我們預先配制好的混合液給細胞換液，孵育過夜，接下第二天，觀察磁珠標記的情況，并拍照，大多數細胞均被標記。為了得到更高的標記效率，第三天我們又進行了富集純化，富集過程如下：1.用胰酶消化細胞，加入3ml的培養基，并將細胞轉移到15ml的玻璃離心中，15000rpm離心5min，棄上清；2.加入新的培養基打勻細胞，用強力磁石富集，棄上清，重復2次；3.加入2.5ml新培養基打勻之后轉移至小培養皿中，4小時之后細胞貼壁之后觀察，并進行拍照，觀察富集情況，對比富集前后的磁珠標記的情況，富集后幾乎每個細胞均被標記。1.2.3收集標記的細胞，制成100ul懸液，皮下注射小鼠左腋下，2周后進行核磁共振成像2結果2．1SPIO標記干細胞的結果干細胞的超順磁氧化鐵顆粒標記：電鏡顯示ESC胞質內散在分布許多囊泡樣結構即吞飲小泡，高密度鐵顆粒主要集中在囊泡內，直徑大約0．8～1．5m(圖1)。鏡檢可見ESC胞漿內存在大量黑色的SPIO顆粒，細胞標記率為90％（圖1）定位、存活數量、移植細胞的分化等。但組織學是有創檢查，而且不能代表全部移植細胞的體內生存情況及其動態遷移[3]。干細胞移植的臨床應用及相關科學研究需要合適的影像學方法對移植細胞在活體進行連續、無創的示蹤觀察[16]活體示蹤移植干細胞的生存狀態及遷移對闡明治療效果的潛在機制及臨床應用的實施有極其重要的作用。MR有良好的軟組織及時間分辨率，無電離輻射，可以在示蹤干細胞的同時評價干細胞移植的治療效果，MR透視引導下精確移植定位的研究已見報道[17]。MRI因其諸多優勢在活體干細胞監測領域成為研究熱點。SPIO對標記細胞毒性低，細胞增殖不受影響。與未標記細胞相比，標記干細胞的細胞活性差異無統計學意義，與文獻報道結果一致［18］。參考文獻[1]沈干，從笑倩，汪錚，吳春芳，曹誼林小鼠胚胎干細胞建系及GFP標記東南大學學報.2003,Mar;22(2):71O74,88[2]MatuszewskiL,TombachB,HeindelW,etal.Molecularandparame-tricimagingwithironoxides[J].Radiologe,2007,47(1):34-42.[3]FrankJA,MillerBR,ArbabAS,etal.Clinicallyapplicablelabelingofmammalianandstemcellsbycombiningsuperparamagneticironoxidesandtransfectionagents.Radiology.2003;228(2):480-487.[4]ArbabAS,BashawLA,MillerBR,etal.CharacterizationofbiophysicalandmetabolicpropertiesofcellslabeledwithsuperparamagneticironoxidenanoparticlesandtransfectionagentforcellularMRimaging.Radiology.2003;229(3):838-846.[5]BosC,DelmasY,DesmoulièreA,etal.InvivoMRimagingofintravascularlyinjectedmagneticallylabeledmesenchymalstemcellsinratkidneyandliver.Radiology.2004;233(3):781-789.[6]KosturaL,KraitchmanDL,MackayAM,etal.Feridexlabelingofmesenchymalstemcellsinhibitschondrogenesisbutnotadipogenesisorosteogenesis.NMRBiomed.2004;17(7):513-517.[7]BulteJW，KraitchmanDL.IronoxideMRcontrastagentsformolecularandcellularimaging[J].NMRBiomed,2004,17(7):484-499.[8]EmeritJ,BeaumontC,TrivinF.Ironmetabolism,freeradicals,andoxidativeinjury[J].BiomedPharmacother,2001,55(6):333-339.[9]LuCW,HungY,HsiaoJK,etal.Bifunctionalmagneticsilicananoparticlesforhighlyefficienthumanstemcelllabeling[J].NanoLett,2007,7(1):149-154.[10]Daldrup-LinkHE,RudeliusM,OostendorpRA,etal.TargetingofhematopoieticprogenitorcellswithMRcontrastagents[J].Radiology,2003,228(3):760-767.[11]金旭紅，楊柳，段小軍，等．體外納米磁帶標注骨髓間充質干細胞生特學特性及其MR成像［J］．第三軍醫大學學報，2008，30（4）：275－279．[12]劉再毅，王瑛，王廣誼，等．超順磁性氧化鐵標記脂肪干細胞移植入大鼠心臟后的活體磁共振示蹤成像［J］．中國醫學科學院學報，2009，31（2）：187－191．[13]NeriM，MademaC，CavazzinC，etal．Eficientinvitrolabelingofhumanneuralprecursorcellswithsuperparagnetieironoxideparticles：relevanceforinvivocelltracking［J］．StemCell，2008，26（2）：505－516．[14]黃鈾新，呂富榮，呂發金，等．超順磁性氧化鐵標記大鼠骨髓問充質干細胞的磁共振成像研究［J］．重慶醫科大學學報，2009，34（3）：318－321．[15]KraitchmanDL,BulteJW.ImagingofstemcellsusingMRI.BasicResCardiol.2008;103(2):105-113.[16]BaiX,AltE.Myocardialregenerationpotentialofadiposetissue-derivedstemcells.BiochemBiophysResCommun.2010;