概述利用人體內的天然物質治療人類的疾病或達到某種醫學效果一直是醫學上的一個重要研究領域。20世紀70年代以來產生了DNA重組技術，這種新技術是現代生物技術的主體，近年來首先在醫藥領域獲得了飛速發展。生物技術的應用2/3用于醫藥，生物技術新型藥物和疫苗已有50多種產品投放市場，400多種正在進行臨床試驗，2000多種在臨床前研究。據報道，國外6500萬人接受重組乙肝疫苗、100萬人接受t-PA治療，超過50萬人使用EPO，每天約有1000萬人接受重組人胰島素的治療。概述利用人體內的天然物質治療人類的疾病或達到1生物技術產品的生產和管理按生物制品的要求進行，不僅對最終產品的質量實施有效控制，而且特別重視對生產工藝的全過程進行質量控制,其中包括對每個生產步驟的驗證、質量檢定（QC）、質量保證部（QA）對生產和質量檢定的全過程進行嚴格的管理。生物技術產品的生產和管理按生物制品的要求進行，不僅對最終產品21、概念：2、分類｛生物技術藥物重組DNA藥物重組蛋白質藥物采用DNA重組技術或其他新生物技術生產的治療和預防藥物。1、概念：生物技術藥物重組DNA藥物采用DNA重組技術或其他3

1、重組蛋白質或重組多肽藥物包括：

細胞因子類：rIFN、IL-2、EPO等；抗細胞素治療：CD4可溶性受體等；重組溶血栓類：rSK、rSAK等；人源化單克隆抗體制劑；重組疫苗和菌苗制劑。1、重組蛋白質或重組多肽藥物包括：42、重組DNA藥物包括：寡核苷酸藥物：反義核酸等；基因藥物：腺病毒-IL-2、腺相關病毒-凝血Ⅸ因子；腺病毒-P53細胞治療制劑：抗原致敏的人樹突狀細胞DNA疫苗：治療乙型肝炎、愛滋病的核酸疫苗等。2、重組DNA藥物包括：5我國生物技術藥物質量標準研究現狀現代醫藥生物技術的發展以及人類基因組計劃的完成和遺傳病基因的不斷發現，對醫藥領域產生了巨大影響。自1982年第一個基因重組藥物—重組胰島素上市以來，全世界約有60余種重組產品開發成功，包括基因工程藥物、基因工程抗體，重組疫苗、反義核苷酸藥物、基因治療藥物、DNA疫苗。我國在“七五”、“八五”、“九五”期間國家“863”高技術項目支持下，先后建立一系列基因重組制品質量標準和質控方法，共完成國家一類、二類新藥20余種產品的質量標準研究。我國生物技術藥物質量標準研究現狀現代醫藥生物技術的發展以及人6生物技術藥物質量標準研究的依據一、主要依照《重組DNA產品質量控制要點》、《中國生物制品規程》、《中國藥典》等要求進行。二、參考世界衛生組織（WHO）和美國FDA頒布的指南、ICH文件和《歐洲藥典》。檢定標準、檢定方法：準確可靠、切實可行；保證產品安全、有效。生物技術藥物質量標準研究的依據一、主要依照《重組DNA產品質7生物技術藥物質量標準研究的內容1、目標產品的均一性2、建立目標產品生物學活性或免疫學效價測定方法3、研究建立目標產品的免疫學活性的測定方法及質控標準4、研究建立國家標準品或參考品5、建立目標產品生產相關雜質的限量分析方法和標準6、制定出保證上述生物技術產品臨床安全、有效、與WHO標準相一致的質量控制標準和規范化的檢定方法生物技術藥物質量標準研究的內容1、目標產品的均一性8

研究建立靈敏、穩定的理化性質、純度、含量的測定方法及質控標準。

研究建立靈敏、穩定的理化性質、純度、含量9

研究建立目標產品的生物學功效的測定方法及質控標準；建立用于藥物生物學功效檢定用的細胞系和動物模型。研究建立目標產品的生物學功效的測定方法10

運用生化標準化原則，以WHO國際標準品為對照，研制出國家標準品或參考對照品。在效價定義上要求與國際單位一致；沒有國際標準品的新藥，則根據標準品要求自行研制國家參比品。運用生化標準化原則，以WHO國際標準品11

外源DNA、菌體蛋白質、細菌內毒素以及病毒、支原體、細菌等在工藝中加入有害物質的檢測。外源DNA、菌體蛋白質、細菌內毒素以及12重組產品質量控制上存在的難點建立重組藥物的生物學活性測定方法；理化測定標準品的穩定性；人源化單抗中的人源化程度檢測方法及標準研究；重組人白蛋白等大劑量重組產品安全性評價問題；反義核酸藥物理化特性測定和效力測定，即如何評價反義核酸的體內及體外活力；基因治療藥物的安全性評價包括反轉錄病毒、生物分布和效力測定；DNA疫苗的安全性和效力檢測方法研究；干細胞治療產品的質量標準的建立（干細胞鑒定及活力測定）。重組產品質量控制上存在的難點建立重組藥物的生物學活性測定方法13我國基因工程產品安全管理

法規和技術指南《傳代細胞系生產生物制品的規程》《人用鼠源性單克隆抗體質量控制要點》《預防用新生物制品臨床研究的技術要求》《人用重組DNA制品質量控制要點》《人的體細胞治療申報臨床試驗指導原則》《人基因治療申報臨床試驗指導原則》《藥理毒理檢查指導原則》《藥品生產質量管理辦法》《藥品注冊管理辦法》我國基因工程產品安全管理

法規和技術指南《傳代細胞系生產生物14生物技術藥物的質量控制生物技術藥物的特點：1、來源：活的生物體（細菌或細胞）；2、結構：復雜（包括組成、空間結構）；3、生產：涉及生物材料和生物學過程（發酵、細胞培養，分離純化等），有其固有的易變性。生物技術藥物的質量控制生物技術藥物的特點：15生物技術藥物的質量控制質量控制包括兩個方面：1、生產過程中質量控制GMP（硬件、軟件）2、最終目標產品的質量控制（方法學研究）生物技術藥物的質量控制質量控制包括兩個方面：16質量控制方法學研究具體內容一、生物學活性測定和比活性二、蛋白質純度檢查三、蛋白質含量測定四、蛋白質藥物理化性質的鑒定五、蛋白質的二硫鍵分析六、對糖蛋白的特殊要求七、殘余雜質檢查八、安全性及其他檢測項目九、生物技術藥物待測樣品保存質量控制方法學研究具體內容一、生物學活性測定和比活性17一、生物學活性測定和比活性

1、意義：1）基因工程產品的化學本質為蛋白質、多肽，其活性由產品的氨基酸序列或其空間結構所形成的活性中心所決定的，與其絕對質量不一致。2）基因工程產品的生物學活性與藥效學基本相一致。3）利用生物學活性建立的測定效價體系，是給藥品定量的依據，保證產品藥效的重要手段。一、生物學活性測定和比活性

1、意義：18效價測定一般原則1、國際通用方法；2、測定結果須用國際或國家標準品校正，以國際單位表示。效價測定一般原則19生物學活性測定方法分類1）體外細胞培養測定法a、促進細胞生長作用（G-CSF:NFS-60）b、抑制細胞生長作用(TNF:L929)c、間接保護細胞作用(IFN:VISH;VSV)2）離體動物器官測定法

采用家兔主動脈條測定重組腦利鈉肽生物活性。3）體內測定法4）生化酶促反應測定法5）免疫學活性測定法生物學活性測定方法分類20取兔離體動脈條剪成約1.5cm長、2～3mm寬的螺旋環，懸掛于含10mL通氧的37℃臺氏液(取NaC18.0g、KC10.2g、CaCl20.2g、NaH2PO40.05g、MgSO4·7H2O0.1g、NaHCO31.0g、Glucose1.0g用蒸餾水配成1000mL的溶液，置于玻璃或塑料瓶中，用1mol·L-1NaOH溶液調pH至7.4)的麥氏浴槽中，加負荷1g，穩定1h，期間每20min換1次臺氏液：連接多導記錄儀，調節靈敏度，記錄血管的張力變化。取兔離體動脈條剪成約1.5cm長、2～3mm寬的螺旋環21待張力曲線基線穩定后，加入1.25mg·mL-1鹽酸去氧腎上腺素溶液0.05mL于麥氏浴槽中使其終濃度為6.25×10-5mg·mL-1，曲線升高至最高并穩定后，開始按累計濃度給藥法(曲線穩定后對倍增加樣品濃度為：6.25×10-5～8.0×10-2RU·mL)加入重組人腦利鈉肽對照品，記錄血管的張力變化。完成上述給藥后，洗脫并穩定1h，期問每20min換1次臺氏液。待基線穩定后，按測定對照品的方法測定待測樣品，記錄測定結果。計算對照品和各實驗樣品的半效稀釋倍數，按下式計算樣品效價：樣品效價=對照品效價×樣品半效稀釋倍數／對照品半效稀釋倍數待張力曲線基線穩定后，加入1.25mg·mL-1鹽酸去氧腎22

利用動物體內某些指標變化，定出產品的單位，如EPO活性測定，體內注射EPO后，計算小鼠網織紅細胞增加的數量與標準品比較，確定其活性單位。利用動物體內某些指標變化，定出產品的單23

基于產品與某種物質的結合或產品本身的化學反應為原理設計，具有簡便、精確、穩定等特點，如重組鏈激酶、葡激酶生物活性測定，鏈激酶、葡激酶和纖溶酶原（h-plg）結合形成復合物激活游離h-plg原為有活性的纖溶酶?；诋a品與某種物質的結合或產品本身的化24

利用制品免疫原性，制備相應單克隆抗體或多克隆抗體，采取ELISA法測定其含量。利用制品免疫原性，制備相應單克隆抗體或25生物學活性測定方法選擇體內測定和體外測定方法a、體內測定：即整體動物測定，能為較大范圍的重組產品的效價提供有用信息，但費時、昂貴、難操作及同時存在倫理問題，大多數情況下傾向于選擇體外測定方法。b、體外測定：可使用分離的器官或組織、原代細胞或傳代細胞系，目前最常用方法是連續生長、因子依賴的、克隆化的細胞系的方法，其測定結果比較準確、重現性好、經濟、容易使用和便于統計分析。生物學活性測定方法選擇體內測定和體外測定方法26生物學活性測定方法選擇2、定量、半定量、定性方法a、通過研究首先選擇能夠定量評價的方法，最好的選擇是背景較低的反應，并且對相關產品有陡峭的、可重復的劑量-反應曲線；其次考慮半定量方法（如NGF），最后考慮定性（如BMP）方法。b、對生產工藝穩定，生物學活性測定方法復雜，可采用其他替代方法（如重組人生長激素用HPLC定量方法代替復雜生物活性測定方法）。生物學活性測定方法選擇2、定量、半定量、定性方法27細胞培養法中細胞染色標記方法

3H-thymidine、BrdU是反映DNA合成、增殖細胞數的比例的。BrdU：首先用BrdU做標記，固定細胞，用核苷酸酶處理后使過氧化物酶結合抗BrdU抗體發生反應。MTT（四氮唑鹽）：其在活細胞的線粒體中可以定量地被琥珀酸脫氫酶還原為難溶性的藍紫色結晶物MTTformazan,二甲基亞砜（DMSO）和酸化的異丙醇或酸化的SDS均能溶解紫色結晶物，通過比色法測定MTTformazan的量可以反映線粒體電子傳遞系統機能，間接表示細胞的生長狀態。細胞培養法中細胞染色標記方法3H-thymidin28

AlamarBlue：氧化型AlamarBlue（600nm）可被活細胞中的線粒體酶還原，還原后染料（570nm）發生顏色和熒光改變，顏色和熒光的深淺與活細胞數成正比，可用分光光度計或熒光檢測儀檢測。Crystalviolet：染活細胞后，在比色計中測定光吸收值（A），A值與著染色細胞數成正比。AlamarBlue：氧化型AlamarBlu29

幾種細胞培養測定方法比較

3H-thymidineBrdUMTT AlamarBlue 靶向物DNA合成系統 線粒體電子傳遞系統

檢出細胞的狀態增殖 增殖、生存檢出法 放射活性 色素、熒光 色素 色素、熒光抽出的必要性 + ++- 其他試劑的必要性+ ++ +- 成本（以MTT為1時） 6080-100（試劑盒）1 2缺點 使用同位素 不適合檢出大量未增殖檢出未增浮游細胞細胞，處理時費力殖活細胞

幾種細胞培養30生物學活性測定分析方法

1、用能誘導50%最大反應的待測樣品最高稀釋度作為參考效價（或滴度），或以此稀釋度中所含樣品的量為1單位，即以此稀釋度的倒數為待測樣品所含的單位數。2、比較已知濃度或活性單位樣品標準品和待測樣品的實驗結果?；钚詷藴势反郎y樣品稀釋度abA值生物學測定基本模式圖生物學活性測定分析方法1、用能誘導50%最大反應的待測樣31蛋白質藥物的比活性測定的意義1、比活性：每毫克蛋白質的生物學活性單位。2、蛋白質的空間結構不能常規測定，而它的改變（如二硫鍵的錯誤配對）可影響蛋白質的生物學活性，從而影響藥效，比活性可以反映此種情況。3、比活性可反映產品生產工藝的穩定情況，可比較不同表達體系、不同生產廠家生產同一產品時的質量情況。4、比活性是重組蛋白質藥物不同于化學藥的一項重要指標，也是進行成品分裝的重要定量依據。蛋白質藥物的比活性測定的意義1、比活性：每毫克蛋白質的生物學32生物活性測定標準范圍確定1、使用驗證過的測定和分析方法，并提供用此方法的效價測定平均值和單測定一批誤差的可信限范圍。2、對于成品的生物活性測定標準，要根據不同方法的特點規定相當標示量的范圍，目前，生物活性的測定方法有四類：動物基礎、細胞基礎、生化（酶）法、特異（免疫、受體）結合法。生物活性測定標準范圍確定1、使用驗證過的測定和分析方法，并提33不同生物活性測定方法的規定標準表測定方法規定標準動物基礎的生物活性測定70%～130%標示量細胞基礎的生物活性測定80%～120%標示量體外酶法的生物活性測定85%～115%標示量受體結合的生物活性測定85%～115%標示量不同生物活性測定方法的規定標準表34生物學活性效價測定過程中

標準品的作用1、生物學活性測定變異范圍大，同樣制品在不同實驗室測定結果差異很大，必須有一個統一的標準。2、標準品的使用，最大限度地減少實驗室之間和各種影響測定因素地干擾。生物學活性效價測定過程中

標準品的作用1、生物學活性測定變異35二、蛋白質純度檢查1、蛋白質純度檢查是重組蛋白質藥物地重要指標之一。2、按WHO規定必須用HPLC和非還原SDS兩種方法測定，其純度都應達到95%以上，有的甚至要求達到99%以上。3、純度的檢查通常是在原液中進行。4、方法：非還原SDS電泳法、HPLC法、毛細管電泳。二、蛋白質純度檢查1、蛋白質純度檢查是重組蛋白質藥物地重要指36非還原SDS電泳法：1、銀染加樣量≥5ug（1～10ng）2、考馬斯亮藍R-250加樣量≥10ug（100ng）結果：無明顯雜蛋白帶出現；目標蛋白量應不低于總蛋白量的95%或98%。蛋白質樣品在荷質比均一。非還原SDS電泳法：37

HPLC法：分子篩、反相層析，離子交換層析，盡量采用與SDS原理不同的反相或離子交換層析，不主張用分子篩分析。毛細管電泳：簡便、快速、靈敏度和分辨率高；價格高、重現性差。HPLC法：分子篩、反相層析，離子交換層析，盡量采用與S38

幾種檢定重組蛋白純度方法的比較特性HPLCSDS、IEFCE分離機制極性、非極性分配，電荷、等電點電荷等分子大小、離子交換分析所需時間10～120min幾小時10～30min分辨力好好好樣品體積10～50ul1～50ul1～50nl靈敏度范圍ng～ugng～ugpg定量準確性+±+分析方式紫外、熒光、折射紫外（可見、熒光）同HPLC電化學、放射性銀染、放射自顯影儀器價格中～高低中～高日常消耗低高低自動化中～高低中～高人力操作低高低制備級中中微量級制備收集樣品可以可以較困難幾種檢定重組蛋白純度方法的比較39

用于研究蛋白質純度的方法和機制

方法分析機制反相HPLC疏水性疏水性相互作用HPLC疏水性毛細管電泳荷質比離子交換HPLC電荷等電聚焦電荷聚丙烯酰胺凝膠電泳電荷比SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳電荷，分子大小分子排阻HPLC分子大小質譜測量法分子大小用于研究蛋白質純度的方法和機制40三、蛋白質含量測定1、此項目主要用于原液比活性計算和成品規格的控制。2、可根據物理化學性質采用Folin-酚試劑法（Lowry法）、染色法（Bradford法）、雙縮脲法、紫外吸收法、HPLC法和凱氏定氮等方法。三、蛋白質含量測定1、此項目主要用于原液比活性計算和成品規格41靈敏范圍：5～100ug/ml；優點：簡便、靈敏度較高；不同蛋白質間的變異少；缺點：受多種物質干擾，反應速度慢，某些試劑不穩定。靈敏范圍：5～100ug/ml；42

Bradford法是采用考馬斯亮藍-G250與蛋白質結合的原理，迅速、靈敏的定量測定蛋白質的方法；靈敏范圍：25～200ug/ul，需要時間：10min。Bradford法是采用考馬斯亮藍-G250與蛋白質結合43靈敏范圍：0.2～2mg/ml簡單、省時受光吸收物質影響蛋白濃度（mg/ml）﹦1.55A280-0.76A260靈敏范圍：0.2～2mg/ml44

蛋白質常用的定量方法的比較方法所需蛋白質破壞蛋白質/蛋白技術方法的變異的量（mg/ml）與否質變化情況復雜性系數（%）雙縮脲0.5～5是少簡單、快速5Lowry0.05～5是中等顯色慢、試劑多5凱氏定氮0.05～3是少干擾、復雜、慢0.154紫外吸收法0.05～2否大簡單、快速、0.439（280nm）干擾物質多染料結合法0.01～0.05是中等簡單、快速3.75熒光法0.001～0.01否中等較易3.75蛋白質常用的定量方法的比較45四、蛋白質藥物理化性質的鑒定特異性鑒別試驗相對分子質量測定等電點測定肽圖分析吸收光譜氨基酸組成分析N末端和C末端氨基酸測序四、蛋白質藥物理化性質的鑒定特異性鑒別試驗46特異性鑒別試驗主要確定蛋白質的抗原性免疫學方法（免疫印跡、斑點免疫、免疫電泳、免疫擴散）：根據抗原抗體特異性反應建立的方法?？贵w中和活性抑制法：此法可用于原液和成品的鑒別試驗，該方法簡便易行、要求抗體必須為中和抗體。特異性鑒別試驗主要確定蛋白質的抗原性47相對分子質量測定還原型SDS：蛋白質在SDS和β-巰基乙醇存在下沸水浴5min，形成表面帶大量負電荷的桿狀分子，降低了分子形態和電荷的影響，在電泳過程中蛋白遷移率基本只與其相對分子質量相關。凝膠過濾（分子篩）法：根據蛋白分子大小和性狀進行測定。相對分子質量測定還原型SDS：蛋白質在SDS和β-48等電點測定重組蛋白質藥物的等電點往往是不均一的，但在生產過程中批與批之間的電泳結果應一致，以說明其生產工藝的穩定性。方法：等電聚焦電泳法(IEF)毛細管電泳法。等電點測定重組蛋白質藥物的等電點往往是不均一的，49肽圖分析肽圖分析可作為與天然產品或參考品的蛋白質一級結構做精密比較的手段。蛋白質一般經化學裂解法及蛋白酶裂解后用HPLC、SDS電泳法、質譜法測定。同種產品不同批次的肽圖的一致性是工藝穩定性的驗證指標。肽圖分析肽圖分析可作為與天然產品或參考品的蛋白質一級結構做精50吸收光譜對某一重組蛋白質來說，其最大吸收波長是固定的。在生產工程中每批產品的紫外吸收光譜應當一致。重組產品一級結構不含芳香族氨基酸，可不做紫外吸收光譜測定。吸收光譜對某一重組蛋白質來說，其最大吸收波長是固定的。51氨基酸組成分析采用微量氨基酸自動分析儀測定，包括蛋白質水解，自動進樣、氨基酸分析、定量分析報告等。有柱前衍生法和柱后反應法，前者是氨基酸先和熒光試劑作用生成衍生物，然后用色譜柱進行分離，檢測氨基酸衍生物的熒光；后者是氨基酸先用色譜柱分離，再與茚三酮、熒胺等試劑顯色后進行分析檢測。氨基酸組成分析采用微量氨基酸自動分析儀測定，包括蛋白質水解，52N-末端和C-末端氨基酸測序作為重組蛋白質和肽的重要鑒別指標，一般要求至少測定N-末端15個氨基酸、C-末端1～3氨基酸。N-末端和C-末端氨基酸測序作為重組蛋白質和肽的重要鑒別指標53五、蛋白質的二硫鍵分析二硫鍵和巰基與蛋白質的生物活性密切相關，發生錯誤配對，不但活性降低而且會引起抗原性增加。五、蛋白質的二硫鍵分析二硫鍵和巰基與蛋白質的生物活性密切相關54六、對糖蛋白的特殊要求評價用生物技術方法生產的糖蛋白時，應考慮糖基化位點的上調或下調及其對生物活性、代謝、穩定性、溶解性的影響。每一種真核細胞具有其獨特的糖基化能力稱為它的糖類型，通過基因工程方法將一種糖蛋白在不同細胞中表達，可以導致生產不同類型的糖蛋白，即使在相同的細胞類型中，也可能會出現糖形成時由于一些寡糖的精細結構不同等而產生截然不同的糖蛋白。六、對糖蛋白的特殊要求評價用生物技術方法生產的糖蛋白時，應考55七、殘余雜質檢測

1、對殘余雜質進行限制的意義a、殘余雜質可能具有毒性，引起安全性問題；b、可能影響產品的生物學活性和藥理作用，或使產品變質；c、反映產品生產工藝的穩定性。七、殘余雜質檢測1、對殘余雜質進行限制的意義56殘余雜質檢測

2、殘余雜質分類a、外來污染物：微生物、熱原、細胞成分（蛋白質、DNA等）、培養基成分、純化步驟引入的成分（親和柱中的抗體、增溶用的SDS）等；b、與產品相關的雜質：突變物、錯誤裂解物，二硫化物異構體、二聚體和多聚體；化學修飾形態（脫酰氨基或氧化形式、其他降解產物）殘余雜質檢測2、殘余雜質分類57殘余雜質檢測內容宿主細胞蛋白含量宿主細胞DNA鼠源型IgG含量（10ng/劑量）蛋白A含量小牛血清殘留量殘余抗生素（氨芐西林）內毒素含量（LAL）產品相關物質其他雜質（加入的離子、SDS、甲醛等）殘余雜質檢測內容宿主細胞蛋白含量58宿主細胞蛋白含量以雙抗體夾心ELISA為宜，盡量不用斑點免疫。常采用5種最常用的E.coli菌株混和作為ELISA測菌體蛋白含量的通用標準。不同表達體系對菌體蛋白含量標準不同。來自E.coli菌株的產品為不大于0.1%；來自CHO細胞的產品為不大于0.05%。宿主細胞蛋白含量以雙抗體夾心ELISA為宜，盡量不用斑點免疫59宿主細胞DNA測定方法：采用DNA雜交實驗，用固相斑點雜交法，以地高辛標記檢測試劑盒或者用同位素標記DNA探針進行測定，必須提供相應宿主細胞DNA標準品。現行生物制品規程對宿主細胞DNA殘留量標準作了相應調整：由小于100pg/劑量調整為小于10ng/劑量。宿主細胞DNA只作為一種細胞污染因素不作為一種危險因素。宿主細胞DNA測定方法：采用DNA雜交實驗，用固相斑點雜交法60 安全性及其他檢測項目無菌試驗熱源試驗異常毒性試驗免疫原性檢查水分、裝量、pH檢測 安全性及其他檢測項目無菌試驗61生物技術藥物待測樣品保存

生物技術藥物大多為具有生物活性的蛋白質、多肽，易受環境條件的影響。根據不同產品原液與成品、凍干與液體制劑的不同要求，可選擇在－20℃、－80℃、4℃和常溫條件下保存。冷凍保存的原液樣品最好分成小包裝保存，避免反復凍溶。生物技術藥物待測樣品保存生物技術藥物大多為具有生物活性的蛋62檢定方法的驗證檢定方法的驗證就是根據方法的需要測定該方法的專屬性、準確性、精密性、直線性、測定范圍、測定限度、測量限度、特異性和耐用性（或可靠性）等幾個指標中的一個或幾個。對于理化測定方法已有了確定的要求和判定標準，而生物學測定的結果具有更大的可變性，一般要使用動物或細胞，這些有機體本身就具有較大的可變性，因此生物學測定的要求和合格標準要松一些。檢定方法的驗證檢定方法的驗證就是根據方法的需要測定該方法的專63驗證時應考慮的問題首先要確定方法的適用性，該方法首先可以得到可重復的、可信的實驗結果，要考慮在以下幾個參數：準確性、精確性、靈敏性、特異性和耐用性（可靠性）。第二，要與已知的方法進行對比試驗，以考查二者間的相互關系。如果在該實驗室內無可對比的老方法，則首先建立標準的方法，用含一定范圍濃度的樣品進行測定，以標準方法所得結果作為標準，用統計學的方法進行對比處理，得出二種方法間的相關系數。對于一個新建立的方法則需要進行協作研究對其適用性進行驗證。

驗證時應考慮的問題首先要確定方法的適用性，該方法首先可以得到64驗證中需測定的參數1、專屬性/特異性（selectivity/specificity）是指當檢測方法對測試樣品中含有制品中應有的其他化合物時，測定待測物的能力。本參數用于鑒別試驗、濃度或效力試驗和純度試驗的測定，以確定使用該檢測方法所測定的結果是否準確地反映了制品的鑒別、效價或純度。特異性就象準確性一樣，一般用偏差或測定值與已知值之間的錯誤率（%）來表示。

驗證中需測定的參數1、專屬性/特異性（selectivity652、直線性（linearity）是測定結果與樣品中測試物濃度的線性關系，該參數的測定將確定檢測方法的測量范圍，它可以表示為回歸直線的斜率和離散性，或者相關系數R和測定系數R2。

2、直線性（linearity）663、測量范圍（Range）

是指當準確性和精密性都能達到要求時所能測得的樣品中待檢物的最高和最低濃度范圍，它就是測定直線性的上下限，如果劑量和反應間的關系不成直線，測量范圍可以通過校正曲線來測得。在《中華人民共和國藥典》中規定測量范圍是指能達到一定精密度、準確性和直線性，測定方法適用的高低限度或量的區間。3、測量范圍（Range）

是指當準確性和精密性都能達到要674、準確性（accuracy）表示測定值與真實值之間的一致性或接近的程度。一般采用填加和回收試驗來測定準確性，即將已知量的樣品加到空白中進行測定，比較測定值與真實值之比。準確性一般表示為偏差或測定值與真值之間的錯誤率（回收率）（即測定值/真實值×100%）。一般對于生物制品而言，因為沒有純的標準品，所以準確性不太實用。生物制品測定時一般與同時進行的參考品進行比較而得，此時的合格標準一般是測定出的參考品值的合格范圍或樣品與參考品之間的比值。4、準確性（accuracy）685、精密性（precision）表示測定值之間的一致性或接近的程度，一般表示為變異系數(CV%)，變異系數即是測定值的標準差與測定值的比值。精密性分幾種：一種是實驗內的精密性（即重復性），它是在同一次試驗內同一個樣品多次測定結果間的變異系數。另一種是試驗間的精密性，它是在同一實驗室內不同次試驗間對同一樣品多次測定結果間的變異系數。實驗室之間的精密性即重現性一般可通過協作研究得到，此參數不適合生產設施的驗證。5、精密性（precision）表示測定值之間的一致性或696、測定限度（LimitofDetection）是指能夠測定出的樣品中測試物的最低量。該量并不一定要定量測出其準確的含量或濃度，LOD是檢查限度實驗中最重要的一個參數。

6、測定限度（LimitofDetection）707、測量限度（LimitofQuantitation）

是指在準確性和精密性都能達到要求時能夠定量測定出的樣品中測試物的最低量。LOQ是檢查測定藥品中不純物方法的一個參數。7、測量限度（LimitofQuantitation718、耐用性（robustness/ruggedness）是通過有效地改變實驗方法的參數，來測定此改變對試驗結果的影響，即實驗結果不受影響的承受程度。參數的改變可以是室溫或培養溫度，或濕度、或改變培養時間，或對試劑的pH進行較小范圍的調整等。在每種試驗條件下，對準確性、精密性、或其他參數進行測定，以確定試驗方法的耐受或承受能力。8、耐用性（robustness/ruggedness）72不同測定方法應進行的驗證的參數參數鑒別試驗雜質檢查效價測定組成測定定量限度準確性

+

++精確性

+

++耐用性+++++直線性和測定范圍

+

++選擇性或特異性+++++測定限度+

+

測量限度

+

不同測定方法應進行的驗證的參數參數鑒別試驗雜質73生物測定的特殊性

由于生物測定的持續性、復雜性、以及參考品和樣品貯存時間較長的特性，除了上述驗證參數外，對于生物測定有另外幾個參數也非常重要，包括：1、試驗順序（front-to-backtest）的影響：它是測定在一個較復雜的試驗中，先測和后測對試驗參數的影響。這是由于它們相對于對照品的測定時間不一樣而造成的。生物測定的特殊性由于生物測定的持續性、復雜性、以及參考7