植物組織培養的歷史發展

組織培訓技術是農業高科技中最重要、最活躍的領域之一。它不僅是農業可持續發展的基礎，也是生物技術最廣泛、最現實的領域。被稱為農業史上的第四次綠色革命。其對解決經濟和社會發展所面臨的人口增長、農業資源匱乏、環境污染等重大問題,具有戰略意義。1組織培養技術方面的研究19世紀30年代,德國植物學家Schleiden和德國動物學家Schwann創立了細胞學說。1902年,德國植物學家Haberlandt在細胞學說的基礎上,大膽提出要在試管中人工培育植物。他預言離體的植物細胞具有發育上的全能性,能夠發育成為完整的植物體。這種細胞全能性的理論是植物組織培養的理論基礎。1948年,我國植物生理學家崔徵和美國科學家合作,用不同種類和比例的植物激素處理離體培養的煙草莖段和髓,發現腺嘌呤和生長素的比例是控制芽和根形成的主要條件之一。1958年,美國植物學家Stewar等用胡蘿卜韌皮部細胞進行培養,終于獲得了完整植株,并且該植株能夠開花結實。這證實了哈伯蘭特在50多年前關于細胞全能性的預言。我國植物快速繁殖和無病毒種苗生產的研究始于20世紀70年代。目前,馬鈴薯無毒種薯和甘蔗無毒種苗已在生產上大面積種植,蘭花、香石竹、月季、菊花、唐菖蒲、百合、重瓣玉簪、橡皮樹、草莓、茶花、桉樹、楊樹、蘋果、柑桔、棗樹、醋栗、葡萄、木薯、香蕉、巴戟天、大蒜、金線蓮、枸杞、半夏、紅花、銀杏等已進行規模化生產或中間試驗。試管苗的年產量,已由20世紀90年代初期的2000萬株左右發展到現在的上億株。利用組織培養技術進行植物快速繁殖及無病毒種苗生產,不僅能夠獲得顯著的經濟效益,同時能夠挽救珍稀瀕危物種和幫助解決藥用植物野生資源短缺問題。花藥培養方面,我國從1970年開始,至今已利用花粉或花藥培育出40多種植物的單倍體植株,其中小麥、黑麥、小冰麥、玉米、橡膠樹、楊樹、辣椒、甜菜、白菜、油菜、柑桔、甘蔗、大豆和蘋果等單倍體植株為我國首創。玉米利用花藥培養獲得了100多個純合自交系,橡膠獲得了二倍體和三倍體植株。僅“九五”期間,就利用花藥培養育成高產、優質、抗逆、抗病新品種44個,種植面積超過667萬hm2。目前,花藥培養作為一種嶄新的育種手段正在植物育種研究工作中發揮巨大優勢。胚胎培養,是應用組織培養方法將早期生長的胚取出培養。胚胎培養有可能培育出雜種植物,解決雜交育種中雜種胚敗育的問題,因而得到了廣泛重視和應用。目前胚胎培養主要應用于一些亞洲國家。中國農業科學院蔬菜研究所培養結球甘藍和大白菜的雜種胚,獲得了種間雜種。西北植物研究所得到了節節草和普通小麥的屬間雜種。大麥+小麥、大麥+提莫菲維小麥、小麥+冰草等也都通過胚培養獲得了雜種。同時,煙草屬間雜種、水稻品種間雜種也都已經得到。中國科學院植物研究所和北京市農林科學院合作,通過胚胎培養育成的早熟桃新品種“京早3號”,成熟期比一般早熟桃提前15~20d。此外,龍眼、荔枝的焦核胚胎培養研究,為果樹選育優良焦核品種開辟了新途徑。原生質體培養方面,到20世紀90年代初期,我國獲得了30個以上品種的原生質體再生植株,其中包括難度較大的大豆、水稻、玉米、小麥、谷子、高粱、棉花等。原生質體培養的成功促進了體細胞融合技術的發展。另外,組織培養技術在藥用植物培養、突變體選育及種質資源保存等方面也有了新的進展。有研究表明,全世界有75%的人口以植物作為治療、預防疾病的藥物來源。僅20世紀90年代以來,植物藥用有效成分的國際專利就達50多項,其中大多為抗病毒、抗癌化合物。由于有些植物生長周期長,繁殖慢,導致市場價格昂貴。如從長春花中提取的抗癌生物堿———長春新堿,用于治療白血病時,售價高達6000美元/g。如果利用組織培養技術,則能較快地獲得提取藥物的大量試材,這樣既能縮短生產周期,又能降低生產成本。在美國,來源于植物的藥物市場約為90億美元。例如,白芷懸浮培養中生成的次生代謝物imperatorin是治療頭痛的主要藥效成分;從薯芋愈傷組織和懸浮細胞產生的diosgennin用于合成甾體藥物;紫杉醇———紅豆杉細胞培養物為最新抗癌藥物,目前,已達到商業化生產水平。通過離體培養篩選植物突變體是生物技術研究中一個較新的領域。篩選植物的有益突變體對提高作物抗逆性和改良作物品質有重要作用;并能為植物遺傳工程研究提供各種帶有遺傳標記的受體突變體細胞;同時對于研究植物體內一些生理生化機理亦有重要意義。如小麥抗赤霉病和根腐病突變體;抗氨基酸及其類似物細胞突變體,如甘藍型油菜抗HYP突變體;逆境脅迫抗性突變體,如小麥抗鹽突變體;抗除草劑細胞突變體及營養缺陷型細胞突變體等。人工種子研究方面,我國人工種子的研究始于“七五”期間,并于1987年被列入了“863高技術研究發展計劃”。采用液氮超低溫保存技術能保持很高的存活率,并且能再生出新植株和保持原來的遺傳特性。如用其建立莖尖分生組織培養物的超低溫保存種質庫時,不僅可防止種質的遺傳變異和退化,而且可長期保存無病毒的原種。我國對水稻、小麥、玉米、甘蔗、馬鈴薯、紅豆、草莓、唐菖蒲、三分三、長春花等植物的莖尖分生組織、愈傷組織、胚狀體、幼胚和花粉等材料,展開材料特性、預處理、光照、冰凍保護劑和降溫冰凍方法對恢復生長的影響以及種質保存后遺傳性狀分析等研究。近20年來有關這方面的研究取得了很大進展。2中國在發展植物群學方面存在的問題和對策2.1組培化植物種類少組培育苗操作程序復雜,在生產中常遇見污染、外植體接種困難、瓶苗生長分化不良、生根難、煉苗移栽成活率低、瓶苗玻璃化等諸多技術難題,雖然通過試驗組培成功的植物已有很多種,但利用組培進行規模化生產的植物種類卻不多。有許多植物是因為某一環節的技術問題難以解決,而不能進行規模化生產。2.1.1組織培養中污染物的控制污染是植物組培過程中的技術難題之一。根據污染發生的對象和出現的不同階段,可分為3種:外植體污染、初代培養污染、繼代培養污染。外植體材料、培養基、接種工具、接種室消毒不嚴格或無菌操作不規范等因素均會導致污染的發生。培養物受到污染在組織培養中經常遇到,并且難以控制,若不能把污染率降低到可接受的范圍,將會造成重大的經濟損失。因此,分析污染的產生和來源,控制污染的發生,成了植物組織培養中的重要工作。對策:對從大田或溫室采集的帶菌植物外植體,應進行一系列的殺菌處理,使污染率降低到可接受的范圍;對于初代培養污染和繼代培養污染,要求組培室所有工作人員都必須嚴格按照規程操作,并且定期進行培養室消毒與操作臺檢查。2.1.2利用培養基內外植體部位作熱壓監測玻璃化現象是由于人工在試管內小環境條件下提供的培養基和培養條件不完全符合培養物固有的需要造成的。由于玻璃化苗的組織結構和生理功能異常,其分化能力低下,難以增殖成芽、生根成苗,成活率低,成為組培過程中的技術難題之一。隨著對玻璃化現象研究的深入,在控制其發生時,大多數研究者均采用如下措施:(1)選不易玻璃化的植物品種及部位作外植體材料。不同植物種類適宜的外植體部位可能不同。吳若箐等研究表明,香石竹的基部莖段發生玻璃化的可能性最大,這可能與不同植物的生理特性有關。(2)利用固體培養基,增加瓊脂濃度;選擇適當的碳源,提高培養基中蔗糖含量;從根本上降低培養基的滲透勢,造成細胞吸水阻遏,減少培養基中植物材料可獲得的水分,可減輕植物試管苗玻璃化現象。李瑤采用通風的方法,有效降低了玻璃化現象的發生頻率。(3)采用通氣性好的封口材料如紗布、脫脂棉等代替聚乙烯塑料膜,可有效降低培養容器內部環境的相對濕度,減少有害氣體的積累,使植物光合作用順暢。(4)選擇適宜的糖源及外源激素的種類和濃度,并注意生長素與細胞分裂素的配合,盡量兼顧繁殖系數。研究表明,培養基中的BA是導致試管苗玻璃化的一個重要原因。選擇合適的激素組合和適當降低培養基中BA的濃度均可減少玻璃苗的出現。(5)通過改善培養條件(溫度和光照)減少玻璃苗的發生。控制溫度,避免過高的培養溫度,進行變溫處理。研究表明適當低溫處理可消除玻璃化。同時,提高光照強度,適當延長光照時間。充分利用自然光照也可以降低玻璃苗的發生頻率。2.1.3外植體褐變的控制褐變是植物組培育苗中常見的現象,以木本植物較為嚴重。酶促褐變是主要因素。一般認為培養材料變褐是由于傷口處分泌的多酚氧化酶(PPO)被氧化成醌類物質,呈紅褐色,并抑制許多酶的活性,影響培養物的正常生長,嚴重時導致其死亡。抑制外植體褐變的措施如下:(1)根據不同時期、不同年齡的外植體在培養中褐變的程度不同,選取褐變程度較輕的材料。如選用早春和秋季的材料作為外植體。(2)用抗氧化劑溶液對外植體進行預處理;或在接種之前用無菌水反復清洗,洗盡外植體切口處滲出的酚類物質;均可起到減輕褐變危害的作用。(3)選擇適宜的培養條件,如低濃度的無機鹽、適當的pH值和適宜的培養環境。如溫度控制在15~20℃,可有效防止褐變的發生。(4)應用抗褐變劑和吸附劑(活性炭等)抑制褐變的發生。(5)在組培過程中,經常篩選并剔除易褐變的細胞。2.1.4季節等特點試驗移栽前,要根據當地的氣候環境、植物種類、設備條件、移栽季節等特點,重點縮小試管苗移栽前后的環境差距和由異養向自養的轉化,使植株能盡快適應自養發育和外界的溫度、濕度、光照強度的變化。同時使其具備一定程度的抗微生物感染能力。2.2簡化培養室條件由于組培育苗生產中所需設備、技術的投入較大,組培育苗程序復雜,使得組培育苗的風險大,生產出的苗木成本相對較高,以致該項成果難以迅速推廣應用。針對這些實際問題,首先應該讓操作人員從操作規程上減小污染,提高成品率,其次還應從培養基的成分和培養條件方面展開研究,以降低成本。宋鋒惠等研究了簡化培養室條件,如采用大玻璃窗的自然光代替日光燈進行組培育苗。結果表明,自然光代替日光燈,不僅有利于植株生長,減少了誘導的培養時間,還可減少設備投入和節約電能;此外,自然光培養苗葉片形狀極小,可減少在接種時因葉片相互纏繞而引起的污染。在培養基成分方面,減少其中的有機成分,不影響試管苗的增殖,還可抑制細菌的生長,減少細菌污染。如采用液體淺層培養代替固體培養,可省去煮瓊脂的電能消耗,而且等量培養基分裝的瓶數比固體培養更多,在進行大量生產時對降低成本有實用價值。祁彥豐等通過用雨水、自來水、蒸餾水配制培養基進行馬鈴薯的培養試驗,發現雨水培養基利于發根,根多而長、葉片數多、植株深綠、生長健壯,有利于移栽。李孟超發現,在不加蔗糖的情況下,在相同的基本生根培養基上,火鶴的繼代苗生長良好,根、莖、葉、株高等的生長情況與加蔗糖處理的基本一致,且移栽后成活率和新生葉片數都高于加蔗糖處理。3組培技術特色雖然組培育苗存在成本高、技術復雜等問題,但隨著科學技術的不斷發展,組培育苗將在未來植物繁殖中占有重要地位。其發展趨勢如下:(1)組培技術育苗植物種類不斷增加。如組培技術育苗種類有果樹、蔬菜、草坪草、花卉、香料植物、藥用植物、茶葉、農作物等,既有草本又有木本。(2)組培技術程序簡化,組培成