鄰苯三酚自氧化法測定超氧化物歧化酶活性的研究摘要：目前超氧化物歧化酶(SOD)活性測定結果混亂，為提高測定結果的可比性，對鄰苯三酚自氧化法測定SOD活性的方法進行了研究，就該活力測定體系中緩沖溶液的介質組成、濃度、pH及所含的EDTA量等因素對測定結果的影響進行了探討，根據實驗結果，提出了新的改良方法.超氧化物歧化酶(SOD)是一種特殊的金屬酶，它能催化超氧陰離子自由基(02—)發生歧化反應，從而能有效清除機體內超氧陰離子自由基(02—),是生物體重要的細胞防御系統之一，具有防御氧毒、抗輻射、防衰老以及防治腫瘤和抗炎等藥用功效［1］，超氧化物歧化酶(SOD)這一獨特的生理功能使其在醫藥領域具有良好的應用前景，激起了人們廣泛的研究熱情.自1969年McCord等首次發現具有活性的超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase簡稱SOD)以來，眾多測定SOD的方法已逐步建立起來，其中以化學法最為常用.經典的鄰苯三酚法是Marklund等［2］于1974年發表的一種通過比色測定SOD的簡便方法?此后，鄰苯三酚法在國內外得以廣泛應用.與其他方法相比，鄰苯三酚自氧化法具有操作簡便，快速，試劑便宜且用量小，重復性好等優點；但文獻報道的鄰苯三酚自氧化法測定超氧化物歧化酶活性的測定條件各不相同，這就造成了測定結果的混亂和缺乏可比性.為此我們對鄰苯三酚自氧化法測定SOD活性的方法進行了研究，就該測活體系中緩沖溶液的介質組成、濃度、pH及所含的EDTA量等因素對測定結果的影響進行了探討.1原理在堿性條件下，鄰苯三酚迅速氧化釋放出超氧化物陰離子，生成有色中間產物，吸光度隨之增加，使吸光度值與反應時間呈良好的線性關系.SOD加入鄰苯三酚自氧化反應體系后，催化超氧化物陰離子生成過氧化氫，使有色中間產物的生成受阻，導致吸光值下降，鄰苯三酚自氧化速率降低，可作為測定SOD活性的理論依據.2材料與方法(1)2.1試劑和主要儀器試劑0.1mol/LTris-HCl緩沖液(pH8.2，內含2mmol/LEDTA)：0.2mol/LTris(內含4mmol/LEDTA)100ml與0.2mol/LHCl44.76ml混合，加雙蒸水至200ml，調pH8.2±0.01;鄰苯三酚(45mmol/L)：以10mmol/LHCl配制成6mmol/L溶液，存放于冰箱備用；所用試劑均為國產分析純；實驗用水為自制雙蒸水；二、 儀器：721型分光光度計(上海第三分析儀器廠)操作方法2.2方法2.2.1鄰苯三酚自氧化速率的測定在試管中按表1加入緩沖液和雙蒸水，于25°C恒溫20min后加入25°C預熱過的鄰苯三酚(對照管用10mmol/L鹽酸代替)，迅速搖勻，立即傾入比色杯中，在波長325nm處每30s測定一次吸光值A0裘：鄰無三斷白瓦化謖率測宦加樣表D-lmolAiTrij-HCllDnunQl/LHCl總雀積如】對照i:4.?4.20.3—S.04,54.2一荒終液川.，?0一一2一雄fniHurx .H/ilj-t-H2.2.2SOD活力的測定SOD活性測定法按上述表1操作，加入鄰苯三酚前，先加入一定量SOD，并減少同體積雙蒸水，其它操作均與上述2.2.1相同，所測吸光度為-一訐=(A,,- .|：.}/Ah\方法2：、試劑及其配制:1.pH8.2,100mM三羥甲基氨基甲烷一二甲胂酸鈉緩沖液（內含2mM二乙基三氮基五乙酸）。以加200mM三羥甲基氨甲烷-二甲胂酸鈉50ml（內含4mM二乙基三氮基五乙酸）加200mN鹽酸22.38ml，然后用雙蒸水稀釋至100ml。2.10mN鹽酸3?6mM鄰苯三酚，用10mN鹽酸配制，4°C保存。4?實驗用水均應用玻璃雙蒸水二、儀器：721型分光光度計（上海第三分析儀器廠）操作方法1?鄰苯三酚自氧化速率的測定:在試管中按表l加入緩沖液和雙蒸水，25C保溫勸分鐘，然后加入25C預溫的鄰苯三酚（對照管用10mMHCI代替），迅速搖勻，倒入比色杯中，在4加nm的分光光度計中，每隔半分鐘測一次OD值，要求自氧化速率控制在0.060OD/分。表1鄰苯三酎自氧化速率測定加持表試 劑加樣屋（皿?殻燼濃豉50.pHS-2和血~pH$.2100mM:脛甲基貫基甲垸匸甲腫戯詁綾沖液供舍岔二乙基三氨基五乙1雙蕪水+.2030.292.SOD或粗醉抽提液的活性瀏定：測定時按表2加樣，測定步驟與測鄰苯三酚的自氧化速率同。表2皐OQ或粗亟抽提液活力測定加樣表加祥量g）f赧絡浹度「I■坯」1OUrriAtr匚於甲毘氨XE甲丈彳二尸腳濮鈉績4鍛〔旳在曲餾-:乙皋三頭華五乙酸[4.ft?_..50,pfia.21m.W—乙華酸）3D或相胸冊提液O,1--4.1EniAf郛茶三齡幣液0.：30.2總注積 ]-■"-―■■ n—--酶活力單位定義:在1ml反應液中，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達 50%時的酶量定為一個活力單位，即420nm0.030D/分為一個活力單位。若自氧化速率在36~65%，通?？砂幢壤嬎?，不在此范圍內的數值應增減樣液量。⑴單位沾力和険潔戈/的計算0.060-單位活力——nx反應液總體積* 讐霧琴畫敎總活力=單位活力W/F訂〉乂驚液總體積（巧蛋口濃度（mg/ml）和總蛋片的計算SO1?或粗酶抽提液，經380run紫外比色測定后「查牛血清白蛋白的標準曲線」由此算岀每ml含“g蛋白的量，蛋白濃度=噸蛋白門rdx巒液稀釋倍數xlO-^mg蛋白金1總?白=mg馥白/mix原液總體積=皿號蛋白<3>比活C^/rng蛋白〕的計算扌注— 單位適力Cn/ml'）比淪 蛋白說愛&請靈百7云巧'逸適戈L_/恵蠶百-"&螢白鄰苯三酚自氧化的機理極為復雜，從實驗來看，鄰苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化，釋放出o易一，生成帶色的中間產物。反應開始后溶液先變成黃棕色，幾分鐘后遂轉綠，幾小時后又轉變成黃色，這是因為生成的中間物不斷氧化的結果。我們測定的是鄰苯三酚自氧化過程中的初始階段，在這階段，中間物的積累在滯后30~45秒后，就與時間成線性關系，一般線性時間維持在4,~411511。中間產物在4幼nm時有強烈的光吸收，在有超氧物岐化酶存在時由于它能催化O玉一與H十結合生成0:和HZO:,從而阻止了中間產物的積累，因此通過計算就可求出SOD的活性。鄰苯三酚自氧化結果見圖1.°。迦昉■町冋〔牯IE2°。迦昉■町冋〔牯IE2陽對自塑也潼竄腎筋m姦gph雲靳總惓機為曲山鄰苯三酚為罠皿鳴卯匕總體機為9咄：鄒苯三靜為山2血乩~n三莪甲基範基甲烷匸甲解嚴鈉盪禪液為聞甲基竝甲整二甲牌卿訓溉（內（為含二乙基三気基五乙轉）， 余：此苛一乙廉_肖斥￡工劉，鄰苯三酚在堿性條件下能迅速自氧化，而在酸性環境中卻相當穩定。為了盡可能使緩沖液的pH維持恒定，要求加樣量盡可能少些，因為PH變化對自氧化速率有較大的影響，見圖2實驗表明:不同pH對滯后時間和線性維持時間影響不大，而對線性速率影響很大。實驗還表明，降低pH要比升高pH對速率影響更大。測定時，要求將反應液pH嚴格控制在8.2，誤差不得超過士0.01。二、不同的鄰苯三酚濃度對自氧化速率的影響:圖3和圖4都表明:不同的鄰苯三酚濃度對自氧化速率有影響。在一定的范圍內，線性速率隨鄰苯三酚濃度的增加而增加，見圖3,這是本法的優點之一。這樣，我們就可在較大范圍內選用鄰苯三酚的濃度，以便更顯著地

觀察鄰苯三酚被SOD抑制的情況。根據圖4的關系表明在溫度和pH不變情況下，可以靈敏地檢測貯存的鄰苯三酚溶液的自氧化程度，以便決定要否新鮮配制。三、溫度對鄰苯三酚自氧化的影響實驗表明，溫度對鄰苯三酚自氧化速率的影響遠比pH要小得多。特別在25一27.5°C時，其影響差別小于4%,基本上不變化。這對測定帶來方便。本法測定的靈敏度與經典的黃嗓吟氧化酶法基本相同。3不同鄰苯三酣敢度下的自軌化曲線懸*鄰菸三前氓度與目竄化速率關柬曲線25弋；,囲甘靳總體積為PrnJ：三宛甲慕氮基甲烷r邪叱*屈乩盍總休積為9ml：三