飼用枯草芽孢桿菌發酵條件的優化周映華;吳勝蓮;賀月林繆東【期刊名稱】《《湖南農業科學》》【年(卷)，期】2010(000)011【總頁數】3頁(P21-23)【關鍵詞】枯草芽孢桿菌;培養基;發酵條件;優化【作者】周映華;吳勝蓮;賀月林;繆東【作者單位】湖南省微生物研究所湖南長沙410009【正文語種】中文【中圖分類】S816.3枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)基我國農業部允許作為飼料添加劑的兩種芽孢桿菌之一，已被越來越多的研制成微生物制劑。其制劑是無毒、無殘留、無污染的〃綠色”添加劑，具有廣闊的發展前景，現已在畜牧業、飼料行業中廣泛應用，顯示出了巨大的社會效益和生態效益。枯草芽孢桿菌具有很強的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性，能產生抗菌素，在動物腸道內具有較強生物奪氧能力，這些特性對促進動物營養的消化吸收、提高動物的飼料轉化率和防病，促進生長起到重要作用。目前在工業化生產中，仍然存在發酵周期長、芽孢形成率低、成本高等問題。筆者對枯草芽孢桿菌發酵培養基及發酵條件進行了研究，以期提高枯草芽孢桿菌的產量并降低生產成本。1材料與方法1.1材料1.1.1菌種供試菌種為枯草芽孢桿菌，由湖南省微生物研究所菌種保藏室提供。1.1.2培養基檢測培養基：牛肉膏0.3%，蛋白腺1%，葡萄糖1%，氯化鈉0.5%,瓊脂2%；種子培養基：牛肉膏0.3%，蛋白腺1%，氯化鈉0.5%,pH7.0~7.2;基礎發酵培養基：淀粉0.15%、葡萄糖0.5%、尿素0.1%、磷酸氫二鉀0.3%、磷酸二氫鉀0.15%、硫酸鎂0.05%、酵母膏0.02%、氯化鐵0.01%、碳酸鈣0.01%、大豆粕1%、淀粉0.3%、3.08%濃度的硫酸錳溶液0.1%。pH均調為7.0~7.2。1.1.3儀器設備供試儀器：SHP-250生化培養箱、1600倍微生物顯微鏡、PHS—25型數顯酸度計、福瑪QYC—211搖床、電熱鼓風干燥箱等。1.2方法1.2.1發酵培養基的優化采用四因素三水平L9（34）的正交實驗，對枯草芽孢桿菌發酵培養24h后，通過稀釋平板計數法測定活菌數，芽孢率采用芽孢染色后顯微鏡下計數比較。光密度（OD600）值測定采用光電比濁計數法，以活菌數的高低作為評價培養基優劣的指標。1.2.2發酵條件的優化（1）溫度對生長量的影響：選取20、25、30、35、37、40OC6個溫度作為搖床發酵溫度，在初始pH7.0，轉速220r/min條件下培養24h，測定其OD600值。（2）起始pH值對生長量的影響：將培養基的初始pH調至5.5、6.0、6.5、7.0、7.2、7.5、7.8、8.0，在接種量5%，溫度30C,轉速220r/min條件下培養24h，測定其OD600值。（3）轉速對生長量的影響：選取150、200、220、250、300r/min5個轉速，在發酵液初始pH7.2，溫度30C條件下培養24h，測定其OD600值。（4）接種量對生長量的影響：選取接種量1%、3%、5%、7%、10%、15%，在30C,初始pH7.2，轉速220r/min條件培養24h，測定其OD600值。1.2.3發酵罐試驗在搖瓶優化的基礎上，進行了20L發酵罐的擴大培養。發酵培養條件為：初始pH7.0~7.2，溫度30°C，轉速220r/min,121°C滅菌30min,起始氣流量比l：0.5。鏡檢芽孢率達到85%以上時，發酵結束。2結果與分析2.1發酵培養基的優化由表1可見，對枯草芽孢桿菌發酵影響的次序為：豆粕〉淀粉〉葡萄糖>硫酸錳，即豆粕對菌體增殖的影響最大，其次是淀粉、葡萄糖，最后為硫酸錳。優化后的發酵培養基為：葡萄糖0.5%、淀粉0.3%、豆粕3%、3.08%硫酸錳0.2ml、磷酸氫二鉀0.3%、磷酸二氫鉀0.15%、硫酸鎂0.05%、酵母膏0.02%、氯化鐵0.01%、碳酸鈣0.01%。表1正交試驗處理123456789I活菌數（108個/mL）3.102.2712.64.400.720.394.850.853.56芽孢率（%）>80>80>80>80>80>80>80>80>80jHjmjKjIj/Kjnj/Kjmj/KjDj葡萄糖（%）0.500.500.501.001.001.001.501.501.5017.975.519.263.005.991.843.094.15淀粉（%）00.150.3000.150.3000.150.3012.353.8416.553.004.121.285.524.24豆粕（%）1.002.003.002.001.003.003.001.002.004.6710.2317.843.001.563.415.954.39硫酸錳（%）00.100.200.2000.100.100.2007.387.5117.853.002.462.505.953.49 2.2發酵條件的優化2.2.1溫度對生長量的影響由圖1可見，在20~30C時，隨著溫度的升高，OD600值升高。在30C時OD600值最大，高于30C時，OD600值反而下降，因而枯草芽孢桿菌的最適生長溫度為30C。圖1不同溫度對枯草芽孢桿菌生長量的影響2.2.2起始pH值對生長量的影響發酵過程中pH難以控制，一般控制發酵液的初始pH。由圖2可見，枯草芽孢桿菌的適宜pH范圍為7.0~7.2。2.2.3轉速對生長量的影響枯草芽孢桿菌是需氧菌，通過改變轉速可以調節通氣量。轉速太小，通氣量小，不利于菌體生長，轉速太大時，菌體生長量反而減少。由圖3可見，隨著轉速的提高，OD600值升高。超過220r/min后，其OD600值反而下降。枯草芽孢桿菌的最適轉速為220r/min。圖2不同pH對枯草芽孢桿菌生長量的影響圖3不同轉速對枯草芽孢桿菌生長量的影響2.2.4接種量對生長量的影響由圖4可見，隨著接種量的增加，其OD600值升高，超過10%的接種量后，OD600值反而下降，因此枯草芽孢桿菌的最適接種量為10%。圖4不同接種量對生長量的影響2.3發酵罐試驗發酵罐試驗結果表明：發酵周期與搖瓶發酵基本一致，含菌量達1.58x1010個/mL,放罐時間20~22h。由于發酵罐的攪拌和通氧條件均優于搖瓶發酵，因此菌體濃度和芽孢形成率都比搖瓶發酵好。3結論采用正交實驗法對枯草芽孢桿菌的培養基進行了優化，通過稀釋平板計數法測定其培養24h后的活菌數，以活菌數的高低作為評價培養基優劣的指標。優化后的培養基為：葡萄糖0.5%、淀粉0.3%、豆粕3%、磷酸氫二鉀0.3%、磷酸二氫鉀0.15%、硫酸鎂0.05%、酵母膏0.02%、氯化鐵0.01%、碳酸鈣0.01%、3.08%硫酸錳0.2mL。并通過單因素實驗法確定了最佳培養條件為：溫度30OC，初始pH7.0~7.2，轉速220r/min，接種量10%。進行了發酵罐放大培養，最適放罐時間20-22h,獲得的菌體數量約為1.58x1010個/mL,為大規模工業化發酵培養提供了有益借鑒。參考文獻：何明清，倪學勤.我國動物微生態制劑研究、開發和應用動態[J].飼料廣角，2002，（21）：1-7.周慶安，劉文剛，鄧留坤，等.動物微生態劑制及其應用[J].飼料博覽，2003，（4）：11-13.李研東.動物微生態制劑的使用現狀及應用前景[J].河北畜牧獸醫，2005，（4）：48-50.康杰，郎淑妮.概述益生菌的功能及應用[J].貴州畜牧獸醫，2008，32（2）：28-29.郝生宏，佟建明，薩仁娜，等.益生菌安全性及其潛在功能研究進展[J].中國畜牧獸醫，2004，31（9）：9-12.秦玉昌，潘寶海，于榮，等.芽孢對畜禽生產性能的影響[J].中國飼料，2004，16:8-10.王進華，戚薇，陳瑩，等.凝結芽孢桿菌芽孢形成液體