生物活性多肽分離純化技術的研究進展

多孔現象廣泛存在于自然界。多孔的研究和應用一直是科學研究的一個重要方向。生物活性多肽由于具有多種人體代謝和生理調節功能,且可作為藥物或藥物前體,食用安全性極高而廣泛受到人們的關注,因此多肽的分離純化也成了一個研究熱點。隨著分離純化技術的進展,大大加快了新活性多肽的發現和合成速度。在多肽合成中,許多雜質顯示與產物類似的性質,隨著肽鏈的增長,分離的難度也增大,因此純化的方法和工藝顯得異常重要。近年來,隨著生命科學研究的不斷深入,用于多肽分離純化的方法得到了很大發展,其中,高效液相色譜由于具有許多其它方法不可比擬的優勢,正受到人們的關注。1備份功能和應用1.1肽類活性物質多肽是由蛋白質中20種氨基酸以不同組成和排列方式通過肽鍵(也稱酰胺鍵)相互連接形成的化合物的總稱。肽具有多樣性,這是因為組成肽的氨基酸殘基的種類不同、數量不同,肽的化學性質與功能都有所不同。肽具有顯色反應,存在雙縮脲反應,在強堿條件下與Cu2+形成紫色絡合物,利用該特征反應,可廣泛用于肽的含量測定。近年來肽類制品已不僅僅應用于藥品、食品,已將它用來預防和阻止SARS病毒、艾滋病毒以及世界范圍內蔓延的多種病毒。目前人們還在不斷的發現,并且分離、純化以及合成多肽類活性物質。總之,多肽物質的開發應用吸引著越來越多的研究者從事這方面的工作。1.2生物活性多肽的應用多肽是涉及生物體內多種細胞功能的生物活性物質。在自然界,所有細胞都能合成多肽物質,其細胞功能活動也受多肽的調節控制。隨著現代蛋白質工程、生物酶工程技術迅速發展,大量具有特殊功能的生物活性肽被發現、開發出來,應用于食品配方、功能性食品、食品添加劑、藥品、化妝品、無公害飼料添加劑等領域。在食品工業上活性多肽具有降低血清膽固醇、降血壓、增強運動員肌肉、恢復疲勞和促進脂肪代謝等功能。另外,小肽還可以與微量元素形成配合鹽,這些配合鹽能借助小肽的吸收特點和機制以配合鹽整體的形式通過小腸被主動吸收,從而促進微量元素的吸收,并增強體內酶的活性,提高蛋白質、脂肪和維生素的利用率,具有較高的生物學價值。2生物多肽的分離純化近年來有關多肽的分離純化方法很多,常見的有高效液相色譜法、超濾法、高效毛細管電泳法等,其中高效液相色譜法應用較為廣泛,其分離效果好,速度快,樣品容量大,回收率高,已成為生物多肽的主要分離純化方法之一。HPLC根據樣品在固定相和流動相分離過程的物理化學原理不同可分為離子交換色譜、凝膠過濾色譜和反相高效液相色譜等。2.1基于思想物質的分離純化離子交換色譜是以離子交換劑作為固定相,交換劑由固定離子基團及可交換的平衡離子組成。當流動相帶著組分離子通過離子交換柱時,組分離子與可交換的離子進行可逆變換,最后達到交換平衡。離子交換色譜法的原理就是根據不同組分離子對固定離子基團的親和力的差別而達到分離的目的。離子交換色譜又可分為陽離子交換色譜和陰離子交換色譜。離子交換色譜可在近中性條件下利用多肽帶電性的不同進行分離純化。劉璇等利用凝膠過濾層析SephadexG-75,通過強陽離子交換色譜SP-650M,從苦瓜籽中分離純化出一種具有雙功能作用的活性多肽。在多肽類物質的分離分析研究中,對多肽的性質、洗脫劑、洗脫條件的研究較多,不同的多肽分離條件有所不同,特別是洗脫劑的離子強度、鹽濃度等對純化影響較大。皮鈺珍等分別采用DEAE52柱與Q-SepharoseFastFlow柱作為離子交換色譜的離子交換柱對鹿胎盤多肽進行了分離,結果表明,與Q-SepharoseFastFlow柱相比較,DEAE52柱流速慢,柱填料再生處理比較繁瑣,每次再生過程中膠的損失量較大,因此Q-SepharoseFastFlow柱更適合此多肽的分離。可以看出,對于不同的多肽提取,所選用的離子交換劑不同,因此環境條件及洗脫條件的確定非常重要,一旦條件選取不當,分離純化效果將會很差。故而,對于各種多肽,研究其最適離子交換劑及其對應最適條件以不斷提高提取效果是研究工作者的研究方向。2.2離子交換系統凝膠色譜法是一種簡便而有效的液相柱層色譜技術。它利用某些化學惰性的多孔網狀結構的物質為填料,通過洗脫液的連續洗脫,使混合物中的各種物質按其分子大小不同得到分離。凝膠過濾層析所需設備簡單,具有操作方便、分離迅速,以及不影響樣品的生物活性等優點,廣泛應用于大分子物質的分離純化。董轉年等通過對天麻初提液兩次超濾、凝膠過濾和快速蛋白液相色譜(FPLC)分離純化,來研究生物多肽對生物機體生命活動的生理作用。孫培龍等通過Superose-12凝膠層析、DEAESepharoseF.F.離子交換層析等手段,對油菜蜂花粉中60%~80%硫酸銨鹽析出物進行分離純化研究,得到一個分子量為36.3kD純度很高的多肽。凝膠色譜也被科研工作者廣泛應用于抗氧化性多肽及其它新型多肽的開發上,如周媛媛等對水解制得的大豆多肽進行超濾膜過濾后,對得到的相對分子質量6000以下的多肽,用葡聚糖凝膠SephadexLH-20進行凝膠色譜分離純化,經研究表明,抗氧化性最好的組分a和組分b的相對分子質量分別約為630和310。凝膠色譜法在分離純化多肽中應用廣泛,但由于色譜柱峰容量有限,分離度較低,不宜用于分子大小及組成相似或相差很小組分的分離,因此通常可作為一種初步分離復雜混合物的手段。使下一步的純化達到更好的效果,往往需要與其它技術聯用,得到高純度的分離純化結果。2.3重組線性奧曲肽反相高效液相色譜是利用非極性的反相介質為固定相,極性有機溶劑或其水溶液作為流動相,根據溶質疏水性的差別進行分離純化的洗脫色譜法。RP-HPLC主要用于分子量低于5000的多肽的分離純化,因其具有分離效果好、分辨率高、重復性好、分析速度快等優點,在多肽的分離純化和制備中得到廣泛應用。隨著研究工作者的不斷努力,近年來RP-HPLC在研究上取得了很大的進步。在分離奧曲肽方面,隨著更多研究工作的深入,純化的純度越來越高。徐仲等使用逐步增長肽合成戰略及碘氧化法對線性奧曲肽進行環化,通過反向高效液相色譜純化,合成純度達70.26%。反相高效液相色譜由于操作簡單,色譜過程穩定,加之分離技術靈活多變性,已成為高效液相色譜中應用最廣泛的一個分支。然而反相高效液相色譜雖具有高選擇性卻不具有毛細管電泳的高柱效性,且費時,價高,因此研究其與其他分離純化方法的聯用技術具有現實意義,成為近年來的一個研究熱點。2.4體外色譜輔助純化多肽的種類很多且大多具有相似性,使用單一的分離純化手段已經不能達到理想的分離純化效果。HPLC有可以進行大規模制備等優點,但存在費時、價高等缺點,因此高效液相色譜與其他分離純化方法聯用技術在多肽分離純化中已顯示出巨大的優越性。任嬌艷集成超濾、離子交換色譜、逆流色譜及凝膠色譜等多種分離技術對草魚蛋白肽進行逐級純化。ParkPJ等運用超濾法從脫卵磷脂卵黃酶解物中分離多肽,又利用高效液相色譜法進一步分離純化了兩種不同的具有很強抗氧化活性的多肽并用毛細管電泳對分離的多肽進行鑒定,結果顯示很高的純度。此外,JeJY等利用連續色譜和串聯電噴霧質譜成功的對金槍魚骨架蛋白酶解物中抗氧化肽進行了分離純化,并對其進行了研究,結果表明,金槍魚骨架蛋白的抗氧化活性肽在亞油酸體系中表現出很高的抗氧化性。高效液相色譜與其他分離純化方法的聯用技術,集中了各種方法的優勢,彌補了各技術的不足,在多肽及其他大分子分離純化的研究上,越來越受到國內外科研工作者的重視。3高效液相色譜分離多肽近年來,有關各種活性多肽的化學合成有了很大的發展,但產物成分比較復雜,一般是以目標多肽為主的幾種結構相似的多肽混合物,因此,對這一混合物的分離純化一直是一個重要的研究課題,對其分離純化的最優化研究也就顯得格外重要。目前,高效液相色譜已成為分離純化多肽行之有效的方法之一,與經典分離純化方法相比,高效液相色譜分離具有效果好、速度快、分辨率高、靈敏度高等優點,有較強的適用性。其次,高效液相色譜在適宜的色譜條件下不僅可以在短時間內完成對多肽的分離目的,更重要的是該法能在制備規模上生產具有生物活性的多肽。然而,目前高效液相色譜分離純化工藝尚不完全成熟,成本較高且費時,有待于科研工作者進一步優化其條件或找到一種較適于分離純化多肽的方法。由于多肽具有多樣性,因此在用高效液相色譜分離純化不同種類多肽時,如何保持多肽活性、如何選擇固定相材料、洗脫液種類也是需要研究的重要內容。有不少學者在尋找多肽類物質分離純化的最佳條件上做了大量的工作。4毛細管電色譜的優勢如何將分離純化的各種技術方法和現代設備有機結合起來,建立一套系統完整的分離研究體系,是今后科研工作者的研究方向。目前,在綜合高效液相色譜和毛細管電泳的優勢而發展起來的毛細管電色譜技