多肽和蛋白質藥物的研究進展

隨著生物技術的發展，許多活性物質和蛋白質被開發出來，并被用于臨床應用。與化學藥物相比,多肽和蛋白質藥物(peptideandproteindrugs,PPD)具有作用靶點專一、不良反應少以及藥效作用強等優點,故在現代疾病的預防和治療中的應用日益廣泛;但多肽和蛋白質由于分子量大、結構相對復雜和理化性質特殊,機體對其產生了多種屏障,如酸屏障、酶屏障和膜屏障,限制了這類藥物的口服吸收。目前,上市的PPD常規給藥途徑多以注射為主。PPD口服給藥是一種方便且提高患者依從性的給藥方式,自20世紀90年代以來,國內外對這一領域的研究非?；钴S。克服PPD的口服給藥技術難題,將會給生物制藥工業帶來巨大變化并造福人類。本文從PPD口服的認識過程、吸收機制、影響因素及提高策略等方面進行了綜述。1ppd口服制劑隨著現代生物技術迅猛發展,多肽或蛋白質不斷被開發成藥品,以紅細胞生成素、干擾素和胰島素為代表的近百種PPD已經在臨床應用。1982年,世界第一個基因工程產品人胰島素上市;1992年,我國第一個基因工程產品干擾素α1b上市。但上述PPD在臨床上只有通過im,iv或sc給藥才能產生治療作用,藥物學家一直致力于PPD口服制劑研究。關于PPD口服吸收,過去人們一直認為蛋白質經胃腸道酶降解后以氨基酸形式被吸收,后來發現其消化產物主要是多肽如二肽和三肽等。20世紀90年代,對PPD口服吸收有了進一步的認識,PPD可通過液相或受體介導的胞飲作用方式吸收入血,對于12個以下氨基酸組成的多肽,實現口服給藥的可能性很大,而對于蛋白質,則難以預料。但是,多學科的合作為PPD口服制劑的成功開發提供了機遇。進入21世紀,對PPD口服吸收機制又有了新的認識,發現一些多肽可通過腸多肽轉運系統吸收入血,拓展了PPD吸收途徑。逐漸意識到要成功開發PPD口服制劑,必須解決酶屏障和膜屏障兩個關鍵問題,利用納米材料、脂質體和酶抑制劑等技術,完全可能在不久的將來攻克這一難題。2多孔藥物和蛋白質藥物的口服吸收機制和方法2.1小鼠感染ppd的轉運小分子藥物的轉運以簡單擴散為主,而PPD口服給藥經過胃腸道主要依靠載體轉運介導通過細胞旁路轉運至小腸黏膜內,如圖1所示,隨后PPD由淋巴回流進入血液循環系統。未被消化酶降解的多肽與腸表面膜基底外側的H+依賴型多肽載體結合,以H+梯度和膜電位差為動力,經多肽載體轉運進入基底膜內側,由于H+與多肽是共同通過上皮細胞膜的,這一系統又稱為H+-依賴型腸多肽轉運系統。2.2ppd的胞飲作用當PPD與小腸黏膜刷狀緣膜的受體結合后,結合部位膜內陷并形成吞噬體而進入小腸壁(圖2),可將40ku大小的完整蛋白質轉運至細胞內,但有很少一部分PPD通過胞飲作用從血管外轉運到小腸上皮細胞內。PPD通過胞飲作用進入小腸上皮細胞,最典型的例子就是通過M細胞途徑(圖3),M細胞是一種位于腸集合淋巴結上的微皺褶細胞,含有M細胞小囊和派伊爾淋巴集結,M細胞表面能吸附顆粒,它可將完整的抗原蛋白或病毒分子經胞吞、胞吐途徑吸收并呈遞給黏膜下免疫細胞。2.3藥物的濃度、電化學勢如圖4所示,PPD可以經過細胞旁路被動轉運,不需要消耗能量,依靠腸上皮細胞兩側的藥物濃度、電化學勢的差別形成的。阻礙PPD經細胞旁路入血的是小腸上皮細胞之間的緊密連接或閉合帶,但是,餐后在腸腔葡萄糖刺激下,腸黏膜細胞骨架收縮,緊密連接暫時開放,某些相對分子質量為0.9~1.9ku的PPD可經此途徑吸收入血。3影響蛋白質和養分口服的因素3.1般情況下的轉運入血時間由于PPD相對分子質量大,人的小腸黏膜細胞間隙為5nm,一般情況下難以透過小腸上皮以簡單擴散的方式轉運入血。小鼠的腸黏膜孔徑約0.4nm,氨基酸、二肽和三肽可以穿過腸壁,多肽和蛋白質則難以通過。3.2硫鍵及其空間結構影響PPD活性的因素主要是氨基酸序列、末端基團、肽鏈和二硫鍵及其空間結構。蛋白質和多肽的三級結構在體外穿過人結腸癌細胞的分子層中發揮了重要作用,這是由于蛋白質的部分展開,使疏水部分暴露,可以穿過液態脂質雙分子層。3.3載體生物利用度低蛋白質是一種親水性高分子化合物,決定了它既不能通過細胞間隙簡單擴散,也難以與細胞膜融合,如果不借助載體則很難通過小腸黏膜入血,因此生物利用度較低。3.4障腸道含有消化酶(1)酸屏障由于大多數多肽和蛋白質不耐酸,胃酸的pH值為1~3,當PPD通過胃時,一部分藥物被水解失去生物活性,而且整個腸道pH環境復雜多變,一些多肽還容易發生pH依賴性水解,這成為PPD口服吸收的第一道屏障難以逾越。(2)酶屏障胃腸道含有,如多種消化酶,主要包括:(1)腔道分泌的酶,如胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶等;(2)刷狀緣分泌的酶,如羧肽酶、氨肽酶、肽鏈內切酶和外切酶等,酶消化作用是導致PPD降解的主要原因,這是PPD口服吸收的第二道屏障。(3)膜屏障首先小腸的上皮細胞附著一層水合凝膠,稱為不流動水層,其下方是磷脂表面活性層,疏水性強,阻礙了PPD等親水性分子向上皮細胞的擴散。其次,小腸上皮細胞膜的磷脂雙分子層具有半透膜性質,允許脂溶性藥物被動轉運,而PPD等大分子以及親水性藥物需要通過主動轉運才能跨膜進入細胞內。最后,阻止PPD口服吸收的主要屏障是致密的腸上皮細胞膜,因為小腸細胞間隙僅為5nm,在不加任何促吸收劑的情況下,只有分子量小的藥物才能通過?？傊?小腸黏膜特殊的組成和結構是PPD口服吸收的第三道屏障。3.5腸道刷狀緣、腸內皮細胞溶酶體有些從胃腸道吸收入門靜脈系統的藥物進入肝后被肝藥物代謝酶代謝,具有首過效應。腸道的刷狀緣、腸內皮細胞溶酶體同樣參與首過效應。膽汁內容物也有一定的作用,包括水解、氧化、脫烷基化和還原等。一部分藥物被這些酶代謝,從而使藥物進入血液循環的有效量減少,故首過效應是導致PPD口服生物利用度低的原因之一。4改善山羊和蛋白質藥物口服吸收的策略4.1可逆酯化反應通過對PPD進行化學修飾形成前藥或衍生物,可以保護PPD免受蛋白酶等消化酶的降解作用,對PPD的結構修飾一般要考慮親脂性、電荷數、等電點、化學穩定性以及對載體的親和力等。例如,酯化反應可將多肽或蛋白質的疏水基團以共價鍵或非共價鍵結合起來,從而提高PPD的親脂性,但酯化反應可能會降低PPD的生物活性,最近研發的一種可逆酯化反應技術可保證酯化的PPD經口服后再生恢復其生物活性,已有幾種PPD經過這種技術改造后,提高其在胃腸道的吸收程度、穩定性及生物活性。聚乙二醇共軛修飾不僅提高PPD脂溶性并且有防止酶解的作用。美國Nobex公司通過親水性聚乙二醇鏈和親脂性烷基鏈在賴氨酸-29位點上對人重組胰島素進行共價修飾,臨床試驗證明可以治療1型和2型糖尿病,生物利用度為5%。4.2干擾膜的生物活性吸收促進劑是一類可逆性增強藥物胃腸道透過性的小分子化合物,是提高生物膜通透性的主要方法。吸收促進劑可以非特異性地暫時打破小腸屏障、改變細胞緊密連接的完整性及擴大細胞間隙,或者通過干擾膜磷脂雙分子層穩定性使其形成小孔,從而提高生物膜通透性,增強PPD等藥物經胃腸道吸收入血。傳統的吸收促進劑如膽酸鹽類、表面活性劑、水楊酸類、氨基酸類衍生物和金屬螯合劑等長期使用后具有一定的不良反應,制約其應用。近年研制的一些不良反應小的新型吸收促進劑,如細胞膜穿透肽,可以介導藥物分子跨膜進入不同組織和細胞,其富含堿性氨基酸的一級結構和螺旋結構對穿膜起著重要作用,日本學者研制基于精氨酸殘基組成的細胞膜穿透肽促進了胰島素經鼻黏膜、口服給藥的吸收。Petrus等用維生素B12與胰島素制成納米粒,有效地促進胰島素口服吸收。4.3a-2-甲基苯甲酰胺的合成酶抑制劑能夠有效地防止酶對PPD的降解,研究表明PPD與酶抑制劑聯合應用后,其口服生物利用度顯著提高。酶抑制劑可分為4類:(1)非氨基酸類P-氨基苯甲酰胺、1,2,3,4-四氫-1-萘甲酸4-(4-異丙基-1-哌啶羥基)-苯酯甲烷磺醋(FK-448)和甲磺酸卡莫司他(camostatmesylate);(2)氨基酸類肽類和修飾肽;(3)胰凝乳蛋白酶抑制劑、氨肽酶抑制劑、桿菌肽和鎮痛素;(4)肽酶抑制劑抑肽酶和胰蛋白酶抑制劑。應用包曼-伯克抑制劑和彈性蛋白酶抑制劑制備殼聚糖降鈣素口服制劑,可以降低其在胃腸道內的降解。4.4腸道納米粒粒徑的確定納米粒是直徑在10~100nm的超微小藥物載體,可通過細胞旁路或腸黏膜派伊爾淋巴集結的M細胞吞噬途徑吸收入血,納米粒包裹PPD可以避免胃腸道分泌的酸和消化酶的破壞,載體納米粒粒徑越小,越易吸收,且具有一定靶向性。制備納米粒的載體材料可分為兩種類型:生物降解型和非生物降解型。有機體內的水解酶可以將生物降解聚合物材料水解成水和二氧化碳,近年來對生物降解聚合物材料的研究更為重視,常見的生物降解型納米材料有交鏈聚酯、聚原酸酯、聚酐和多肽等。以研究胰島素口服制劑等為代表的載體納米微粒見表1,其中殼聚糖納米粒在開發口服胰島素用于治療糖尿病取得了一定的成效。4.5降血糖作用的藥物脂質體的結構與細胞膜雙層脂膜結構類似,可通過腸黏膜細胞的吸附、脂質交換、融合和內吞等作用機制,增強細胞攝取藥物,特別是促進了派伊爾淋巴集結對藥物的攝取。而且,脂質體保護PPD等藥物免受胃腸道酶的降解,起到緩釋作用,延長半衰期。Kv等等制備沙雷菌肽酶(serrationpeptidase)脂質體并以Caco-2細胞模型研究發現,脂質體劑型比原藥有更好的跨膜轉運效果。Hanato等制備的胰高血糖素樣多肽脂質體在動物實驗中具有良好的降血糖作用。但是,脂質體用于PPD載體存在兩個問題:(1)脂質體在制備過程中,PPD的包封率較低;(2)脂質體的不穩定性,因為胃腸道存在的膽鹽會破壞脂質體的雙分子層結構,使脂質流失,導致脂質體的穩定性比較差。4.6乳化油制劑乳劑中的油相可增加PPD的膜通透性、也可能增加藥物的淋巴轉運,從而提高生物利用度。早在1997年Cortecs公司就開發了胰島素油制劑,通過兩親性表面活性劑的作用,將親水性藥物如胰島素、降鈣素等增溶至弱極性的油中形成澄清透明的溶液,6例健康志愿者口服該制劑后血糖降低34%。國外已有環孢素微乳軟膠囊上市,國內也將胰島素制成復乳,ig給予小鼠后有顯著降血糖作用,北京大學研制的蚓激酶油包水口服微乳具有較好的可行性。4.7ppd面包的制備胃腸道存在PPD特異性吸收的位點,如果使PPD在此釋放,可避免各種消化酶的降解作用,最大程度地提高PPD的口服吸收,一般從結腸和小腸考慮定位釋藥。PPD吸收的最佳部位可能是大腸,因為藥物在此停留20~30h,而且消化酶的活性較低。研究較多的是結腸定位釋藥,它具有延長藥物的滯留時間、降低酶活性和增強吸收促進劑的作用等優勢,常用α-淀粉、果膠鈣、殼聚糖、海藻酸、丙烯酸酯偶氮苯水凝膠以及果膠/半乳甘露聚糖等作為包衣材料。小腸的某些區域存在著與免疫有關的特定組織區域,如派伊爾淋巴集結能使淋巴因子和一些顆粒進入循環系統,使用腸溶衣或其他控釋技術使藥物在小腸釋放,可能增加PPD的吸收。4.8對家蠶生物反應器的預測和治療Page等認為基因工程在PPD口服制劑開發方面具有很大潛力,口服基因藥物遞送載體包括病毒載體和合成高分子載體等,如霍亂毒素B亞單位對GM1神經節苷脂(細胞膜糖脂類受體)有高度親和力,當霍亂毒素B亞單位連接到包裹抗原的脂質體表面時,小鼠口服給藥后,可顯著升高黏膜免疫球蛋白A和免疫球蛋白G水平。有人將熱休克蛋白A和霍亂弧菌封閉小帶毒素兩個基因進行融合,并在大腸桿菌中高效表達,研制成幽門螺桿菌熱休克蛋白A-霍亂弧菌封閉小帶毒素融合蛋白質口服疫苗。本實驗室采用家蠶桿狀病毒表達系統對PPD口服給藥做了系列研究,利用基因工程改造功能基因并在家蠶桿狀病毒表達系統表達一些用于口服的重組蛋白如霍亂毒素B亞單位-重組人胰島素、重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、重組人乳鐵蛋白、重組人生長激素、重組人破骨細胞形成抑制因子和口服基因工程疫苗等。Gong等構建霍亂毒素B亞單位人胰島素融合基因,利用家蠶桿狀病毒高效表達霍亂毒素B亞單位-重組人胰島素融合蛋白,ig給予非肥胖型糖尿病小鼠后抑制了胰島炎癥和糖尿病病理癥狀的發生;Meng等在家蠶桿狀病毒表達系統里成功表達了霍亂毒素B亞單位-重組人胰島素-綠色熒光蛋白融合蛋白,對該融合蛋白經小腸黏膜轉運過程進行追蹤,發現其ig給予10周齡的非肥胖型糖尿病小鼠后,產生了特異性抗體,并且誘導CD4+CD25+Foxp3+T細胞的產生,延緩1型糖尿病的發作,改善其癥狀。目前,這項利用家蠶生物反應器生產的胰島素口服制劑是一種治療1型糖尿病的新型藥物,現處于中試階段。家蠶生物反應器表達的重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子,ig給予小鼠、Beagle犬和獼猴后,具有升高白細胞作用;健康志愿者口服后其生物利用度平均為1%,現處于Ⅱ期臨床研究階段。Liu等在家蠶細胞中表達重組人乳鐵蛋白,表達量約為13.5mg·L-1,小鼠ig給藥后,可有效緩解葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠急性結腸炎癥狀。5ppd口服制劑自從1982年世界第一個基因工程產品人胰島素問世以來,大量的PPD就被開