TakarapMD?19-T寶生物工程(大連)有限公司pMD?19-TVector是一種高效克隆PCR產(chǎn)物（TACloning）的專用載體。本載體由pUC19pUC19XbaI和SalI識(shí)別位點(diǎn)之間插入了EcoRV識(shí)別位點(diǎn)，用EcoRV3“T”而成。因大部分耐熱性DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)都有在PCR3’由于本載體以pUC19載體為基礎(chǔ)構(gòu)建而成，所以它具有同pUC19載體相同的功能。此外，本制品中的大大方便了實(shí)驗(yàn)操作。本制品中的ControlInsert（500bp）Control本載體與pMD?18-TVectorβ-半乳糖苷酶的表達(dá)活性更高，菌落顯示藍(lán)色的時(shí)間縮短，pMD?19-TVector（50μl×1μl×1Solutionμl×2 存：- TAPCR對(duì)克隆后的PCR產(chǎn)物使用BcaBESTTM pMD?19-TVector- 頁制品說 制品內(nèi) pMD?19-TVector的結(jié) 實(shí)驗(yàn)操 ControlDNA片段的克隆實(shí) 一種可供選擇的快速克隆 相關(guān)說 使用注 【pMD?19-TVectorBcaBESTSequencingPrimerM13-47bindingBcaBESTSequencingPrimerRV-MbindingLacZColE1pMD?19-T1Control135μl（等量）SolutionI。3）16℃反應(yīng)30分鐘。注）①室溫（25℃）X-Gal、IPTG、AmpLPCRControl（cfu/μg效率＋90-0DNApMD?19-T1Insertupto55μl（等量）的SolutionIpMD?19-TVector是一種高效克隆PCR產(chǎn)物（TACloning）的專用載體。本載體由pUC19載體改建而成，在pUC19XbaI和SalI識(shí)別位點(diǎn)之間插入了EcoRV識(shí)別位點(diǎn)，用EcoRV進(jìn)行酶切反3‘端添加“T”而成。因大部分耐熱性DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)都有在PCR產(chǎn)物的由于本載體以pUC19載體為基礎(chǔ)構(gòu)建而成，所以它具有同pUC19載體相同的功能。此外，本制品中的ControlInsert（500bp）ControlpMD?19-TVector（50 20μl×1ControlInsert（50 10μl×1Solution 75μl×2* TAPCR對(duì)克隆后的PCR產(chǎn)物使用BcaBESTTMSequencingPrimers、M13Primers進(jìn)行DNA(2,692bp)pMD?19-T(2,692bp)--【pMD?19-TVectorBcaBESTSequencingPrimerM13-47bindingBcaBESTSequencingPrimerRV-MbindingLacZColE1ControlDNADNA5μlpMD?19-T1Control135μl（等量）的SolutionI。3）1630注）①室溫（25℃）②5全量（10μl）100μlJM1093042451890μlSOC培養(yǎng)基，3760X-Gal、IPTG、Amp的LPCRControl連接/（cfu/μg效率＋90-0*DNAInsert一般DNADNA5μlpMD?19-T1Insertupto55μl（等量）的SolutionI

-注） PCR（2kb）DNAX-Gal、IPTG、AmpLPCRpMD?19-T1Insertupto55μl（等量）SolutionI。3）16℃反應(yīng)30分鐘。注） PCR（2kb）DNA pMD?19-TVector Control爾數(shù)約為0.15pmol。 在進(jìn)行克隆時(shí)，VectorDNAInsertDNA1：2～10 DNA1630注） 室溫（25℃）也能正常進(jìn)行連接反應(yīng)，但反應(yīng)效率稍微降低 5 PCR（2kb）DNA全量（10μl）100μlJM1093042451890μlSOC培養(yǎng)基，3760X-Gal、IPTG、Amp的LPCR一種可供選擇的快速克隆法DNA5μlpMD?19-T1Insertupto55μl（等量）的SolutionI。3）1630注） 室溫（25℃）也能正常進(jìn)行連接反應(yīng)，但反應(yīng)效率稍微降低 5 PCR（2kb）DNA4）2μl上述連接液（10ngVectorDNA）microcentrifugetubes2min。5）50μlE.coliJM109CompetentCellmicrocentrifugetubes5min。6）X-Gal、IPTG、AmpL-瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)（3730 pMD?19-TVector Control0.15pmol。 InsertDNA在進(jìn)行克隆時(shí)，VectorDNAInsertDNA的摩爾比一般為：1：2～10 DNA片段的方法，可--InsertDNAInsertDNATakara（TakaraCode：D301D823A）InsertDNA進(jìn)行克隆時(shí)，VectorDNAInsertDNA1：2～10，我們可以根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)情況VectorDNAInsertDNA的摩爾數(shù)比。InsertDNA使用量的計(jì)算方法如下：InsertDNA（ng）=nmol660×InsertDNAbp1μl（50ng）0.03pmol。片段成功插入至p?19-TVeco中后，一般情況下-半乳糖苷酶的表達(dá)將受到破壞，重組克隆體在含有X-alIPTAp的L-片段LacZ2kb的PBcaBESTMSequecngPriesP擴(kuò)增。ControlInsert100.1ng的pUC19PlasmidDNA100μl900μl的SOCμl），記錄菌落數(shù)。以得到200個(gè)克隆體為例計(jì)算轉(zhuǎn)化效率，此時(shí)的轉(zhuǎn)化效率=200cfu/0.001ng=2×105cfu/ng=2×108cfu/μgpUC19DNA。SolutionI克隆時(shí)使用的InsertDNA片段（PCR產(chǎn)物）建議進(jìn)行切膠回收純化，否則PCRDNA（甚至是電泳也無法確認(rèn)的非特異性小片段、殘存引物等雜質(zhì)都會(huì)影響TA克隆效率。20μlDNADNA劑（TakaraCode：D605A）DNA的回收率。連接反應(yīng)請(qǐng)?jiān)?5℃以下進(jìn)行，溫度升高（>26℃）較難形成環(huán)狀DNA。連接效率偏低時(shí)，可適當(dāng)延長(zhǎng)本制品來源于pUC19載體，因此，適合pUC19載體的感受態(tài)細(xì)胞都可以使用，如：JM109

-InsertDNA回收時(shí)可使用Takara凝膠回收試劑盒（TakaraCode：D301D823A）。進(jìn)行克隆時(shí)，VectorDNAInsertDNA1：2～10，我們可以根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)情況選擇合適的VectorDNA和InsertDNA的摩爾數(shù)比。InsertDNA使用量的計(jì)算方法如下：本載體1μl（50ng）的摩爾數(shù)約為0.03pmol。DNApMD19-TVectorβ--GalITAp的LDNALackb的DNAPRBaBETMSequncingPrimes，PC使用試劑盒中提供的ControlInsert，可以進(jìn)行10次陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。cfu/ng=2×108cfu/μgpUC19DNA。SolutionI克隆時(shí)使用的InsertDNA片段（PCR產(chǎn)物）建議進(jìn)行切膠回收純化，否則PCR產(chǎn)物中的短片段DNA（甚至是電泳也無法確認(rèn)的非特異性小片段、殘存引物等雜質(zhì)都會(huì)影響TA20μlDNA備進(jìn)行電轉(zhuǎn)化時(shí)，需對(duì)連接液進(jìn)行乙醇沉淀，純化DNA劑（TakaraCode：D605A）可以提高DNA的回收率。連接反應(yīng)請(qǐng)?jiān)?5℃以下進(jìn)行，溫度升高（>26℃）較難形成環(huán)狀DNA。連接效率偏低時(shí)，可適當(dāng)延長(zhǎng)pUC19載體，因此，適合pUC19JM109.確認(rèn)KOD、Pfx、Pfu等）擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物是平滑末端，不能直接進(jìn)行TA純化PCR產(chǎn)物。最好使用切膠回收的PCR片段，以除去PCR產(chǎn)物中的非特異性片段和引物等雜Takara（TakaraCode：D301D823A）108cfu/μgpUC19DNADNA片段的立體結(jié)構(gòu)、DNA片段的長(zhǎng)短都會(huì)影響克隆效率。一般情況下，大片段DNA的克隆效率（連接效率與轉(zhuǎn)化效率）進(jìn)行切膠回收純化DNA片段時(shí)，不要使DNASolutionIDNADNA片段較短（500bp）LacZ基因的讀框，此時(shí)平板培養(yǎng)基上出DNA本載體來源于pUC19載體。因此，用于pUC19pMD?19-TVector與pMD?18-TVectorpMD?19-TVector與pMD?18-TVector相比，β-半乳糖苷酶的表達(dá)活性更高，菌落顯示藍(lán)色的時(shí)間縮短，菌落顯示的藍(lán)色更深。pMD?18-TVector連接轉(zhuǎn)化后，一般要經(jīng)37℃過夜培養(yǎng)，然后再將其于冰箱內(nèi)pMD?19-TVector10（37℃）便可以呈色。因此，pMD?19-TVector比pMD?18-TVector更適合于藍(lán)白菌落的篩選。--技術(shù)咨詢熱線：技術(shù)咨詢熱線：0411-寶生物工程（大連）有限公司TakaraBiotechnology(Dalian)Co., 真址：KOD、Pfx、Pfu等）PCRTAPCRPCRPCR質(zhì)。進(jìn)行切膠回收時(shí)可以使用Takara凝膠回收試劑盒（TakaraCode：D301或D823A）。108cfu/μgpUC19DNADNADNADNADNADNADNADNA（500bp），LacZ基因的讀框，此時(shí)平板培養(yǎng)基上出欲對(duì)克隆DNApUC19pUC19pMD?19-TVector與pMD?18-TVectorpMD?19-TVector與pMD?18-TVector相比，β-半乳糖苷酶的表達(dá)活性更高，菌落顯示藍(lán)色的時(shí)間縮短，菌落顯示