微生物在生物圈的化學平衡中起著十分重要的作用,但我們對于維持這種平衡的微生物生態(tài)系統(tǒng)的構造和動力學參數(shù)知之甚少.其中最大的原因就是：研究方法的局限性。傳統(tǒng)研究方法的局限性傳統(tǒng)的研究方法：通過純培養(yǎng)獲得菌株后，對其特性進行描述，即通過其表型特征、細胞的性質(形態(tài)學、生理生化反應和細胞組成成分結構的觀察)的觀察得到其特性。在自然環(huán)境中能夠純培養(yǎng)的微生物菌株的數(shù)量還不到自然界微生物總數(shù)的1%。由于純培養(yǎng)是檢測這些微生物性質的前提,因此這一限制使得自然界的大多數(shù)微生物特征很難被具體描述。傳統(tǒng)方法得到的性狀為微生物進化關系的研究提供的信息很有限,

很難對微生物進行精確分類并構造系統(tǒng)發(fā)生樹。

DNA雜交技術DNA雜交技術和微生物分子系統(tǒng)學的發(fā)展使得我們可以擺脫純培養(yǎng)條件的束縛,開辟了一條更客觀的探索環(huán)境中微生物多樣性的新思路。理論上講,微生物間的進化相關性是通過它們各自基因組的核苷酸序列(一級結構)來決定的,對于單個基因的序列比較可以用于比較微生物相對進化關系。兩界系統(tǒng)理論的建立根據古微生物的化石標本分析,30億年前出現(xiàn)了自養(yǎng)細菌,20多億年前出現(xiàn)了藍細菌,15億年前首次出現(xiàn)真核生物,即原核生物出現(xiàn)在先,真核生物出現(xiàn)在后。基于以上分析,細胞進化上真核細胞起源于原核細胞。這就是早期生命進化的兩界系統(tǒng)理論。此學說認為所有的生命都可以劃歸這兩界之一,而且認為原核生物類似于真核生物的祖先,因而真核生物就是從古代的原核生物進化而來的。“三界”理論的建立近20年來,細胞生物學與分子生物學的大量研究工作表明,原核生物并不是統(tǒng)一的一大類,在極早的時候就已經分化為兩大類:真細菌與古細菌。“三界”理論的建立建立在rRNA一級結構信息基礎上的系統(tǒng)發(fā)生關系的研究表明，原核生物應分為兩界：古細菌和真細菌，這兩界彼此不同。古細菌、真細菌和真核生物三者之間不存在誰起源于誰的問題,而是相互平行的，三者都起源于共同的祖先,這一祖先稱為原始細胞。“三界學說”由此誕生,目前已利用rRNA信息作為標尺建立了系統(tǒng)發(fā)生樹。古細菌分子遺傳學方面的研究表明：古細菌的遺傳信息傳遞機制與真核生物的相似,古細菌與真核生物在進化上的關系較原核生物更為密切，因此近年真核生物起源于古細菌的觀點得到了加強，很可能真細菌首先從古細菌和真核生物的共同干線中分支出來。“三界學說”和生命樹的定量化提供了一種全新的研究微生物生物多樣性的視點,并提示了大多數(shù)微生物都具有遺傳多樣性。

16SrRNA基因序列分析Pace等首次利用rRNA基因確定環(huán)境樣品中的微生物,通過對5SrRNA基因的序列分析來研究微生物的生態(tài)和進化。該方法很快被用于微生物多樣性研究領域。由于5SrRNA基因相對較小(約120個核苷酸),攜帶信息相對較少,因而揭示微生物群落多樣性的能力有限。相比之下,隨后開展的16SrRNA基因序列(約1500個核苷酸)分析為微生物多樣性研究提供了更多信息,且效率更高。16SrRNA為原核生物核糖體中一種核糖體RNA,大小約1.5kb左右.其種類少,含量大(約占細菌RNA含量的80%),分子大小適中,存在于所有的生物中,特別是其進化具有良好的時鐘性質,在結構與功能上具有高度的保守性,素有“細菌化石”之稱。16SrRNA既能體現(xiàn)不同菌屬之間的差異,又能利用測序技術來較容易地得到其序列,故被細菌學家及分類學家所接受。細菌的16SrRNA可變區(qū)序列因不同細菌而異，恒定區(qū)序列基本保守，可以利用恒定區(qū)序列設計引物將16SrRNA片斷擴增出來,利用可變區(qū)序列的差異來對不同菌屬、菌種的細菌進行分類鑒定。通過對其序列的分析，可判定不同菌屬、菌種間遺傳關系的遠近。16SrRNA基因序列分析是主要基于已建立的微生物16SrRNA基因序列數(shù)據庫,用以確定細菌的系統(tǒng)發(fā)育關系,并使序列探針用于識別未知菌(unculturedmicrobes)成為可能.不少學者利用16SrRNA基因序列分析技術研究了多種環(huán)境的微生物多樣性,并得到了一些有意義的結果.如海洋中浮游細菌的遺傳多樣性;不同污染物對細菌群落多樣性有顯著的作用;農業(yè)土壤微生物群落顯著生理活性差異及其多樣性;氧化光能利用菌群落16SrRNA基因的豐度與其形態(tài)型顯著相關。一、分子生物學技術的應用隨著分子生物學技術的發(fā)展,DNA標記技術已成為探討種群遺傳變異的重要選擇。從環(huán)境樣品中提取和純化總DNA的方法不斷得到發(fā)展,從而可對環(huán)境樣品中微生物總DNA進行PCR(polymerasechainsreaction)擴增。遺傳多樣性檢測的分子標記主要包括:限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)、DNA擴增指紋分析(DAF)、擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)、16SrRNA基因序列分析等,目前應用較廣的是基于微生物16SrRNA特異性基因序列的標記技術。基于分子雜交技術的分子標記核酸分子雜交技術是20世紀70年代發(fā)展起來的一種嶄新的分子生物學技術,它是基于DNA分子堿基互補配對的原理,用特異性的cDNA探針與待測樣品的DNA或RNA形成雜交分子的過程。由于它的高度特異性和靈敏性,近年來被廣泛應用于微生物多樣性的研究中。用于微生物多樣性研究的探針主要是有雙鏈DNA、單鏈DNA和RNA以及寡核苷酸探針等三類,可對有關微生物在特定環(huán)境中的存在與否、分布模式和豐度等情況進行研究。目前微生物多樣性研究中應用較多的是原位雜交技術。對環(huán)境樣品中提取的DNA作數(shù)量印跡雜交(quantitativedotblot),可獲得有關特定DNA序列豐度的信息。其主要原理是基于專一性探針(如特定16SrRNA基因探針)、通用型探針(如總16SrRNA基因探針)和環(huán)境樣品中分離的總DNA可分別進行雜交,其特定DNA(如16SrRNA基因序列)的相對豐度可用此兩類探針雜交信號的比值加以確定,用以間接反映特定的微生物細胞的數(shù)量或特定種群的相對生理活性等。對rDNA的擴增產物或rRNA的反轉錄產物作Southern雜交（southernhybridization),其主要原理是基于微生物的rRNA基因的信號序列在不同物種層次上存在差異。根據這些不同層次的信號序列而設計的特定寡核苷酸探針可檢測相應微生物的層次。原位雜交對環(huán)境樣品直接作原位雜交(insituhybridization),是細胞學方法與分子雜交技術相結合的產物：利用熒光標記的具有特異性的核酸片段為探針,與中期細胞的染色體或間期細胞核的DNA雜交,在染色體上或核中顯示與探針同源的DNA片段的位置,從而將這段DNA序列定位在細胞中。此技術可獲得未知菌的微生物多樣性的大量信息,如微生物的形態(tài)特征和豐度以及在樣品上的空間分布和動態(tài)。由于是對環(huán)境樣品直接進行檢測,所以獲得的結果理論上應更能反映自然環(huán)境下微生物的多樣性特征。這種研究成功的關鍵是前期研究工作的積累,尤其是已具有對屬、種或種群等具特異性的DNA探針.如Jain等采用特異性的探針對地下水中的細菌進行原位雜交,研究了細菌有關質粒基因的存在和分布情況;Barkay等研究了汞污染土壤中抗汞細菌的種類、數(shù)量和變化趨勢等。全細胞雜交對微生物菌落作全細胞雜交(whole-cellhybridization),可提供比用探針作Southern印跡雜交更直觀的信息。最初此方法以放射性標記的rRNA基因探針用于鏡檢單個微生物細胞。Lobet-Brossa等也曾應用熒光標記的rRNA基因探針對海底沉積物微生物群落進行雜交分析。基于PCR技術的分子標記PCR技術是美國科學家Mullis發(fā)明的一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法,其目的是將極微量DNA進行大量特異性擴增。此技術的原理是將DNA片段經過若干次解鏈和復性循環(huán),大量擴增，甚至可擴增到十幾億倍,以便于對已知DNA片段進行分析,如基因分析、序列分析、進化關系分析等。目前,在微生物生物多樣性領域應用最為廣泛的是以微生物的16SrRNA保守性基因為基礎設計引物進行PCR擴增,分析基因序列研究微生物群落的多樣性。樣品來源及模板制備：用以抽提模板DNA的樣品只需極少量,且模板也極低,只需幾個納克,抽提過程較為簡單,可用經典的DNA或RNA提取法。對稱PCR(SymmetricPCR)：根據選用的引物來擴增模板DNA的特異性雙鏈片段.這個過程引物的設計至關重要。若設計不合理,擴增出非特異性片段,則會導致的推斷.一般來說,引物應位于待分析基因組中的高度保守區(qū)域,以15～30bp為宜。微生物的系統(tǒng)發(fā)育特征僅僅需要分析一個或幾個遺傳因子的序列,利用PCR技術研究系統(tǒng)進化一般要進行以下程序:

不對稱PCR(AsymmetricPCR)：利用對稱PCR的雙鏈產物作為其擴增的模板DNA,控制兩種引物的用量之比1/50或1/100,就可根據單引物來擴增出特異性的單鏈DNA。堿基序列測定及多態(tài)性分析

(1)單鏈構象多態(tài)技術(SSCP):

它根據形成不同構象的等長的DNA單鏈在中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳遷移率變化來檢測基因組DNA多態(tài)性。當單鏈DNA鏈內發(fā)生單堿基插入或缺失時,它在中性聚丙烯酰胺凝膠中的二級空間構象發(fā)生改變,導致電泳遷移率變化而產生泳動變位,在電泳譜帶上表現(xiàn)出多態(tài)性。PCR-SSCP分析主要包括PCR擴增和凝膠分離兩步驟,經典的PCR-SSCP分析需要在PCR反應體系中加入放射性r-32p-ATP標記引物(labledprimerPCR)或加入α-32p-dCTP標記底物(LN-PCR)進行擴增,擴增產物經凝膠分離后,經放射自顯影顯示SSCP.這種方法費時、耗錢、操作復雜、限制了該技術的廣泛應用.后來,人們將此技術進一步改進,成功地將銀染顯色和溴化乙錠染色法用于此技術分析,直接在聚丙烯酰胺凝膠上顯示SSCP,以取代同位素標記引物或底物,實現(xiàn)SSCP的非放射性同位素檢測,從而使該技術更加簡便,快速有效.PCR-SSCP技術主要優(yōu)點有兩點:一是能檢測出單堿基突變引起的基因變異;二是快速、簡便,適應于大樣本篩選。PCR-SSCP技術只對小片段的PCR產物高度靈敏,對于大片段PCR產物,需借用雙向凝膠電泳進行SSCP分析。該技術檢測結果受電泳條件影響很大,有時可能檢出假陰性結果,解決方法是通過設置陰性對照,摸索最佳電泳條件,以期最大程度上消除假陰性結果.變性梯度凝膠電泳技術(DGGE)(2)變性梯度凝膠電泳技術(DGGE):

其原理是基因組DNA在不同的變性劑濃度下,解鏈溫度(Tm)隨之變化,從而使電泳遷移率改變,產生泳動變位,凝膠譜帶上表現(xiàn)出多態(tài)性.該技術有二個主要特點:一是一個引物的末端常需附加45～50nt富含GC序列的GC發(fā)夾,以便檢測出靶DNA所有解鏈區(qū)域單個堿基的變化;二是擴增產物多為100～500bpDNA片段,更大片段的擴增產物檢測靈敏度低.DGGE有二種電泳方式:垂直DGGE和水平DGGE,前者變性劑濃度梯度方向與電泳方向垂直,適于分析單個樣品的解鏈性質;后者變性劑濃度自上而下呈線性增加,多用于檢測多個樣品的DNA多態(tài)性,該項技術的特點主要是可檢測出單堿基的基因變異,因而和SSCP一樣適合于檢測由點突變造成的微生物遺傳多樣性.利用DGGE檢測擴增產物,多態(tài)性位點更加豐富,多態(tài)信息含量加大.例如將DGGE和RAPD技術相結合,多態(tài)性RAPD標記可增加30%～50%.這非常有利于親緣關系很近的品系、居群間遺傳關系的分析,對快速尋找目的基因的連鎖標記也大有裨益該方法主要缺點有二點:一是需要與DGGE相配套的電泳設備(電泳溫度維持在60℃)、價格昂貴;二是當需要檢測長于500bp的基因組DNA片段單堿基變化時,需結合其它方法,如限制性內切酶法和RNA探針法,付出更大努力方能達到這一目的.DNA自動測序法(3)DNA自動測序法:

在4個反應管中,具有不同的熒光特點的標記引物使每種堿基帶有特異性.在反應分別完成后,4種系列產物在一條泳道中電泳而被分離.熒光標記的片段通過檢測器時被監(jiān)測,利用片段發(fā)射的特異波長和電泳遷移時間(指示片段大小、片段大小對應對于堿基在DNA序列上的位置)的不同而確定DNA序列.DNA序列數(shù)據分析(4)DNA序列數(shù)據分析:

通過PCR得到特異性DNA片段的堿基序列只是進化研究工作中的一個中間環(huán)節(jié),最終還必須對這些數(shù)據進行分析推斷.目前分析序列數(shù)據的方法大