生物檢定法1/29**生物檢定法定義：p103生物檢定屬生物法分析，是利用藥品對生物體（整體動物、離體組織、微生物等）作用以測定其效價或生物活性一個方法。它以藥品藥理作用為基礎，統計學為工具，選取特定試驗設計，在一定條件下比較供試品和相當標準品所產生特定反應，經過等反應劑量間百分比計算，從而測得供試品中活性成份效價。2/29因為生物差異存在，生物檢定結果誤差較大，重現性比較差，需要控制條件較多

測定費時、計算繁瑣。所以，生物檢定主要用于無適當理化方法進行檢定藥品，補充理化檢驗不足。因為科學技術發展，一些品種生物檢定可能被理化檢驗代替，而一些新藥生物檢定方法又在不停建立。3/29生物檢定包含整體和離體測定整體測定：直接反應藥品對生物綜合作用，但需要動物、

需用供試品量多，耗時長、精密度和靈敏度較差。離體測定：個體差異小，試驗時間較短，精密度和敏度較高，能在一定程度上保留藥理作用特征，尤其適合用于微量激素測定，缺點是不一定能反應供試品在整體作用。4/29一、生物檢定應用范圍

1．藥品效價測定

對一些理化方法不能測定含量或理化測定不能反應臨床生物活性藥品，可用生物檢定來控制藥品質量。比如洋地黃、胰島素、肝素、絨促性素、縮官素等生物測定法，以

及各種抗生素微生物測定法。有些天然藥品、生物制品往往因結構復雜，而且往往又是由結構類似、百分比不定各種成份組成，極難用理化方法反應其生物活性；另一些藥品，尤其是一些激素類藥品，其結構相近相近，而生物活性不一樣；還有些藥品雖可用理化方法測定含量，但含量完全不能反應效價。所以這些藥品質量控制都離不開生物檢定。5/292.體內微量生理活性物質測定

一些神經介質、激素等微量生理活性物質，因為其很強生理活性，在體內濃度很低，加上體液中各種物質干擾，極難用理化方法測定，而不少活性物質生物判定法因為靈敏度高，專一性強，對供試品稍作處理即可直接測定。6/293.中藥質量控制

中藥成份復雜，大部分中藥有效成份還未搞清，難以用理化方法加以控制，一部分中藥可用一些以其療效為基礎生物測定方法來控制其質量。7/294、一些有害雜質程度檢驗如農藥殘留、熱原質、抗生素及生化制劑中降壓物質程度檢驗等。8/29標準品

生物檢定法，普通需要應用標準品，以降低因為生物差異造成試驗誤差，使在不一樣試驗室中檢定同一藥品時，即使試驗條件或影響原因不盡相同，但因為同時作用于標準品和供式品，在比檢定中這些影響原因能夠相互抵消，它們之間反應強度百分比保持不變這么就大大提升了生物檢定可靠性和精密度。藥典所采取標準品：為參考國際標準品制備標準品，由中國藥品與生物制品檢定所發放，單位效價相當于國際單位效價。標準品有均勻、穩定而持久性質，應存放于除去氧氣干燥器中，低溫處避光貯放。9/29效價檢定基本內容

（一）生物反應是生物檢定基礎

被測物特有生物學作用都可作為生物法分析基礎，比如生長素含有促進生長、蛋白質同化、脂肪動員作用，可致糖尿、血酮，影響鹽類代謝，已據之設計出各種生長素生物學定量法（見書上表5-1）。10/29（二）劑量與反應關系

生物檢定是利用藥品不一樣劑量引發生物體反應程度改變以進行藥品效價測定，要計算效價，首先要研究劑量與反應之間關系。

在生物檢定中，劑量與反應間普通都是曲線關系，可經過各種坐標轉換方法，使劑量與反應間呈直線關系，即數學表示式為簡單直線方程：y=a+bx，最便于處理和應用。生物反應基本上可分為以下兩種類型，即質反應和量反應。11/29*1．質反應

當一定劑量藥品注入動物體內后，觀察某一反應或反應某一特定程度出現是否比如死或不死，驚厥或不驚厥，只有出現與不出現兩種情況，故不能用量來表示個體反應程度，只能用一組動物中出現正（或負）反應百分率來表示，如死亡率、驚厥率，這類稱質反應。12/29在質反應中，將動物分組，分別給以不一樣劑量，經過調整劑量，使最大劑量組靠近但

不全部產生陽性反應，最小劑量組靠近但不全部產生陰性反應，則各組陽性反應動物百分率隨劑量增加而遞升，劑量與反應率之間關系是一條長尾“肩斜”形曲線，如

將劑量轉換為對數，反應率轉換為適當函數后則呈直線關系，常見轉換方法有概率單位

logit、角度等。13/29*2．量反應

藥品對生物體所引發反應伴隨藥品劑量增加產生量變能夠測量者，稱為量反應比如血壓改變值，血糖濃度、組織器官重量增減，抑菌圈直徑大小等。時反應雖有一些特殊性，但基本上仍可屬于量反應，它是觀察某一反應或反應某種程度出現所需時間，比如血液凝結時間、動物生存時間等。14/29（三）對比檢定

生物檢定目標是將供試品（T）和已知效價標準品(S)進行效力對比，依據它們反應程度，求供試品效力相當于標準品效力倍數，再從中計算出供試品效價，所以它屬于對比檢定。15/29胰島素生物檢定法

胰島素是從哺乳動物胰8胰島口細胞中提取一個蛋白類激素，為六方系結晶，相對分子量6000，易溶于80%乙醇和酸性水溶液，在pH2.5酸性溶液中比較穩定。

*胰島素主要藥理作用是降低血糖，大劑量注入可引發驚厥、休克甚至死亡。16/29胰島素生物檢定法-詳細方法本品效價測定采取生物檢定法，基于其有降低血糖作用而采取小鼠血糖法、小鼠驚厥法、家兔血糖法。長期有效制劑延效作用只能用血糖法。17/29肝素生物檢定法

肝素系由健康牛、豬、羊等食用動物肺、肝、腸粘膜中提取有延長凝血時間作用粘多糖類物質，為白色或淡黃色無晶形粉末，有吸濕性，在水中易溶。本品相對分子質量及抗凝血效價隨動物種屬和臟器起源不一樣而有差異，相對分子質量為6000-0，由肝肺提出肝素，每mg不得低于110U，由腸粘膜提出肝素，每mg不得低于140U。**本品在中性及微堿性中較穩定。18/29肝素生物檢定法-詳細方法肝素生物檢定法是依據對數劑量與血凝時間對數呈線性關系而設計，慣用有兔全血法，硫酸鈉兔全血法，另外還有使用牛、羊血法測定肝素效價方法。19/29抗生素微生物檢定法

因為抗生素多為結構復雜多組分物質，異構體多，且不穩定，輕易產生降解雜質故各國藥典均以微生物檢定法為主要含量測定法。因為抗生素藥品醫療作用主要是它抗菌活力，而微生物檢定法正是以抗生素抗菌活力為指標來衡量抗生素效價一個方法。其測定原理與臨床要求相一致，能直接反應抗生素醫療價值，所以一直是各國藥典所采取主要測定方法。

20/29微生物檢定法測定抗生素效價，普通可分為：稀釋法比濁法瓊脂擴散法以瓊脂擴散法應用最為廣泛，為當前國際上測定抗生素效價通用方法。21/29**瓊脂擴散法-管碟法原理

瓊脂擴散法，亦稱管碟法。系利用抗生素在瓊脂培養基內擴散作用，采取量反應平行線原理設計，比較標準品與供試品二者對接種試驗菌產生抑菌圈大小，以測定供試品效價一個方法。22/29將不銹鋼小管安置在攤布特定試驗菌瓊脂培養基平板上，當小管內加入抗生素溶液后，抗生素分子就隨溶劑向培養基內呈球形擴散。同時將培養基平板置培養箱中培養，試驗菌就開始繁殖。抗生素分子在瓊脂培養基中濃度，隨離開小管距離增大而降低。當抗生素分子擴散到T時間，這時瓊脂培養基中抗生素濃度恰高于該抗生素對試驗菌最低抑菌濃度，試驗菌繁殖被抑制而展現出透明抑菌圈。在抑菌圈邊緣處，瓊脂培養基

中所含抗生素濃度即為該抗生素對試驗菌最低抑菌濃度。將已知效價抗生素標準溶液與未知效價供試品溶液在一樣試驗條件下進行培養，比較二者抑菌圈大小。23/29因為同質抗生素對特定試驗菌所得兩條劑量反應曲線為平行直線，故可依據此原理，設計一劑量法、二劑量法及三劑量法（《中國藥典》只收載了二劑量法和三劑量法）等，從而能夠較準確地對比出供試品效價。24/29**影響效價測定原因1．試驗菌種2．培養基3．雙碟制備4．雙碟培養溫度和時間25/29生物制品效力檢定

生物制品效力，從試驗室檢定來講，一是指制品中有效成份含量水平，二是指制制品在機體中建立自動免疫或被動免疫后所引發抗感染作用能力。對于診療用具，其效力則表現在診療試驗特異性和敏感性。制品質量，主要是從效力上表達出來。無效制品，不但沒有使用價值，而且可能給防疫、治療或診療工作帶來貽誤疫情或病情嚴重后果。所以，必須十分重視制品效力檢定，有制品必要時還要進行人體效果觀察。26/29效力檢定方法有兩大類：一是體外測定