CELLENGINEERING細胞工程編輯ppt第一章緒論4個學時

第二章實驗室配置及根本技術2個學時

第三章植物細胞工程的理論根底4個學時

第四章植物組織器官培養技術6個學時

第五章植物細胞培養及次生代謝產物生產3個學時

第六章原生質體培養和體細胞雜交3個學時

第七章人工種子及植物種質資源保存2個學時

第八章胚胎干細胞培養2個學時第九章動物細胞培養4個學時

第十章動物細胞融合與單克隆抗體4個學時

第十一章動物組織與胚胎工程1個學時

第十二章試管動物與克隆動物1個學時

課程初步安排：36學時

編輯ppt第七章胚胎干細胞培養干細胞是什么ES/EG細胞的培養及建系技術ES/EG細胞的體外誘導分化誘導分化細胞的永生化ES/EG細胞技術學在醫學中的應用ES/EG細胞技術學面臨的問題和研究趨勢編輯ppt一、干細胞〔stemcells〕是什么?具有無限的或延長的自我更新能力的細胞?能產生至少一種類型的高度分化的細胞編輯ppt

從具有的分化潛能上講：--專能干細胞--多能干細胞--全能干細胞編輯ppt從組織發生即來源上講：

--胚胎性干細胞

--成體干細胞/組織干細胞編輯ppt胚胎性干細胞是一類來自早期胚胎、原始生殖細胞等源于胚胎的干細胞，根本特征是有穩定地在體外自我更新、穩定地維持正常核型和發育全能或多能性、能夠分化為屬于三胚層范疇的各種類型分化細胞，甚至參與個體發育。--來自早期胚胎：胚胎干細胞〔embryonicstemcells,ES〕--來自胚胎生殖嵴中的原始生殖細胞：胚胎生殖細胞〔embryonicgermcells,EG〕--來自畸胎瘤組織：胚胎性癌細胞〔embryonalcarcinomacells,EC〕編輯ppt－－1981年，Evens和Martin分別成功的別離和體外培養了小鼠的胚胎干細胞；－－1995年，Thomson等人別離建立了第一株靈長類動物的胚胎干細胞；－－1998年，Thomson等建立了第一株人類胚胎干細胞；－－1998年，Shamblott等建立了第一株人類生殖干細胞；－－2002年3月，美國麻省理工學院科學家宣布，他們首次利用人體胚胎干細胞培育出毛細血管，證明了胚胎干細胞技術在治療心血管疾病等領域的應用潛力；－－目前已有報導，ES細胞在離體適當條件下分化為心肌細胞，胰島細胞及血管內皮細胞，肝細胞等。編輯ppt成體干細胞〔adultstemcells,AS〕，也叫作組織干細胞〔tissuestemcells〕是指一群分布在成體組織中處于尚未分化的、具有自我更新并負有構建和補充某種組織的各種類型細胞潛能的干細胞。如骨髓的造血干細胞、間充質干細胞；神經系統的神經干細胞；肝干細胞；骨骼肌干細胞等。--造血干細胞可分化為血液系統的各種細胞；小腸和皮膚中的干細胞具有分化、補充和更新小腸和皮膚組織的能力。--骨髓干細胞除了形成各種血細胞和衍生于間質細胞的各類細胞外，還可被誘導分化為神經細胞、肌肉細胞、骨和肝細胞等不同分化細胞。編輯ppt編輯ppt二、ES/EG細胞的培養建系技術

別離囊胚的內細胞群與成纖維細胞共培養，ES細胞非分化增殖別離胚胎生殖腺細胞胚胎干細胞的鑒定定向誘導分化功能細胞編輯ppt編輯ppt1、ES/EG細胞的來源(1)發育良好的囊胚，從中別離ICM，進一步別離培養ES細胞(2)從胚胎生殖腺中別離出EG細胞從畸胎瘤中別離出EC細胞治療性克隆即體細胞核轉移〔SCNT〕途徑別離培養ES細胞

編輯ppt編輯ppt編輯ppt2、ES/EG細胞的分化抑制培養目前常用的細胞分化抑制物主要有三種:--飼養層細胞(feederlayer)--特殊細胞的條件培養液(conditionedmedium),如BRL(Buffaloratliver)細胞條件培養液--分化抑制因子(differentiationinhibitoryfactor,DIF),如白血病抑制因子(leukemiainhitory

factor,LIF)編輯ppt飼養層細胞培養法：常用的飼養層細胞有以下兩種：〔1〕MEF細胞(mouseembryonicfibroblast)，取自各種品系小鼠的12dpc胚胎。經剪碎和胰蛋白酶消化，常規分散細胞培養為單層散布的成纖維細胞。〔2〕STO細胞，來自SIM小鼠(S)胚胎的對硫代鳥嘌呤(T)和烏本苷(O)有抗性的成纖維細胞系，能分泌干細胞生長因子(stemcellfactor,SCF)以及白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor,LIF)。編輯ppt無飼養層培養法：飼養層細胞的制備在一定程度上使ES/EG細胞培養顯得較繁雜。近來以添加LIF生長因子或某些特定細胞的條件培養液至含FCS的正常培養液，借此替代飼養層細胞：〔1〕直接在ES細胞根底培養液中參加重組LIF〔2〕Buffalo大鼠肝細胞條件培養液(BRL-CM)〔3〕2～3周幼年大鼠心肌細胞條件培養液(RH-CM)編輯ppt3、ES/EG細胞系的特性和鑒定〔1〕形態學特征〔2〕發育全能性和分化潛能鑒定〔3〕嵌合體動物編輯ppt〔1〕形態學特征

體外培養小鼠ES/EG細胞在抑制分化培養中呈現一個或幾個核仁、且核質比高的圓形或卵圓形細胞，彼此均呈單層或多層緊密堆積而形成島狀或巢狀群體生長形態，組成克隆的細胞彼此界限不清楚，粘連性強。

人ES與EG細胞的形態學特征有所不同，與小鼠ES/EG也有所不同。單層培養時，人體ES細胞呈扁平狀群落，且細胞界限清楚。編輯ppt〔2〕發育全能性和分化潛能鑒定

小鼠和包括人在內的靈長類動物全能或多能性胚胎性干細胞，具有特有的表達標志以及在體內外的分化特點。編輯ppt干細胞標記鼠類EC鼠類ES鼠類EG人類EC人類ES人類EGSSEA-1+++--+SSEA-3---+++SSEA-4---+++TRA-1-60---+++TRA-1-80---+++AKP++++++Oct-4++++？+小鼠與人類多能干細胞標記蛋白表達譜編輯pptSSEAs(stage-specificembryonicantigen):時期專一性胚胎抗原TRA-1-60、TRA-1-81:腫瘤排斥抗原AKP：堿性磷酸酶在小鼠及靈長類的ES細胞中活性較高，在已分化細胞中活性明顯降低；

Oct-4:是生殖系專一性轉錄因子。作為和胚胎發育全能/多能性相關的轉錄因子，Oct-4通過多種調控機制激活或抑制不同靶基因的轉錄，在細胞的全能/多能性及未分化狀態的調控和維持中發揮重要作用。端粒酶(telomerase):一類核糖核蛋白，與維持真核細胞染色體末端的端粒長度和控制細胞壽命有關。人ES細胞的端粒酶活性高，而分化細胞一般難以檢測到；胚胎干細胞的特異性表達標志：編輯pptES/EG細胞在體外被刺激分化為各種類型細胞是其最根本的屬性;ES/EG細胞接種于同一品系的小鼠或免疫缺陷小鼠腹股溝、眼窩、腹腔等可以形成由內胚層、中胚層和外胚層細胞構成的畸胎瘤。胚胎干細胞的體內、外分化特點：編輯ppt組織和器官的細胞由含有兩個或兩個以上基因型構建而成的完整個體稱為嵌合體動物〔chimaera〕。把ES/EG細胞注入胚泡或與桑椹胚聚集，使其與正常胚胎結合在一起，并參與宿主胚胎發育，可形成嵌合體動物的各種組織和器官，包含生殖系嵌合體動物可通過毛色、皮膚顏色等外觀指標進行判定或是取器官組織進行同功酶檢測(3)嵌合體動物編輯ppt三、ES/EG細胞的體外誘導分化編輯ppt1、根本原理細胞誘導分化是一個細胞與其微環境相互間復雜而又精密協調的分子細胞學過程，是胚胎正常發育過程中重要而根本的現象；

ES細胞是體外研究誘導分化的較理想模型，在體外被誘導分化的途徑可能與在體胚胎細胞的不完全相同；在體胚胎的細胞分化過程中，誘導作用的結果不只是決定于各種誘導物質的性質和專一性，同時也決定于被誘導細胞的反響能力(competence)。后者受遺傳、發育潛能等內在因素的限制；編輯pptES細胞體外誘導分化實驗中，所用誘導物質繁多，誘導模式不盡相同，按其作用機理大致分為兩類：--使被誘導細胞可逆性輕度損傷，導致神經細胞分化無機物、有機酸、醇、亞甲基鹽、硫氫化物等--誘導物通過其與被誘導細胞外表的受體結合而誘導細胞分化類固醇激素、維甲酸衍生物、多肽生長因子等同一種誘導物可以誘導出不同類型細胞或變化多端的構造，不僅涉及誘導劑的濃度差異、誘導作用模式和微環境的未知因素等，而且可能與被誘導細胞本身的發育潛能和對誘導劑的反響性等差異有關。編輯pptES細胞體外誘導分化途徑可分為：--譜系分化〔lineagedifferentiation〕，有利于認識組織譜系細胞分化機理和全過程。ES細胞譜系祖細胞譜系定型細胞終末分化細胞--定向分化〔committeddiffereniation〕，需設法控制導向產生單一類型的分化細胞。對ES細胞轉染細胞專一的轉錄因子、標志基因、細胞分化因子結合報告基因和誘導條件選擇等手段，探索定向誘導分化途徑編輯ppt編輯ppt編輯ppt2、ES細胞體外誘導分化的根本方法單層ES細胞培養和誘導分化：較難分化為單一類型的細胞ES細胞擬胚體形成和誘導分化：相對誘導分化細胞類型較單一,具體方法有：〔1〕軟瓊脂培養〔2〕懸滴培養

編輯ppt制備ES單細胞懸浮液培養皿蓋上接種20ul/滴，直徑10cm的培養皿蓋蓋上帶有懸浮細胞小滴的蓋子培養皿內加PBS培養皿邊緣用膜封置37℃，5％CO2培養箱培養3d后，轉移擬胚體至含細胞分化誘導劑的培養皿或微孔板進一步培養然后,移放入鋪有0.1%白明膠的培養皿或微孔板內在培養液中再培養可被誘導分化為不同類型細胞ES細胞體外懸滴培養編輯ppt3、ES細胞體外誘導分化舉例造血細胞內皮細胞與血管神經細胞脂肪細胞心肌和其他肌肉細胞軟骨細胞胰島細胞編輯ppt小鼠ES細胞擬胚體在體外可以分化為類似于早期胚胎卵黃囊血島樣的結構并分化產生各種造血系統的細胞：①用胰蛋白酶消化小鼠ES細胞擬胚體成單個細胞，經干細胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)和條件培養液處理，誘導其定向分化為造血干細胞；②用原代骨髓基質細胞作飼養層和SCF及IL-6細胞因子處理可進一步使ES細胞來源的造血干細胞分化為B淋巴細胞系。造血細胞編輯ppt內皮細胞與血管小鼠ES細胞擬胚體在體外可以分化為類似于早期胚胎卵黃囊血島樣的結構，其中也有內皮細胞出現：①利用經轉化生長因子β1(TGF-β1)基因轉染的小鼠ES細胞在含RA培養液中經懸滴培養形成擬胚體；②再繼續貼壁培養，發現擬胚體周圍呈輻射狀長出許多血管樣結構。將外源重組TGF-β1添加至培養液，同樣也能誘導內皮細胞組成的血管樣結構。編輯ppt心肌和其它肌肉細胞

懸浮或懸滴培養的小鼠ES細胞擬胚體在RA誘導條件下貼壁生長數天，常出現某些分化細胞集落具有節律性自發收縮的現象，顯然是肌細胞：DMSO誘導ES細胞擬胚體可以形成心肌、平滑肌和骨骼肌等多種類型肌細胞，用肌肉專一性的調節因子MyoD基因轉染ES細胞并結合DMSO誘導處理，額外表達MyoD基因的ES細胞主要分化為骨骼肌且常融合成肌管。編輯pptES細胞定向誘導分化是至今仍未解決、正在探索中的問題。根據國外少數報道和國內的經驗，對ES細胞轉染細胞專一的轉錄因子、標志基因或是有關細胞分化因子等遺傳操作，并結合誘導條件選擇等手段，是一條可能的探索ES細胞定向誘導分化的途徑。編輯ppt四、ES/EG細胞誘導分化細胞的永生化

尋找建立ES/EG細胞誘導產生的分化細胞永生化途徑是目前ES/EG細胞研究領域待解決的問題。編輯ppt五、ES/EG培養與誘導分化的意義哺乳類發育的體外模型人體的基因和細胞治療組織工程的種子細胞來源編輯ppt編輯ppt哺乳動物早期胚胎一般體積很小，又在宮內發育，在體內研究胚胎發育和各類細胞分化及其機理幾乎不可能；ES細胞具有完整的發育潛能性，而且對所有調節正常發育的信號具有應答能力。雖然ES細胞體外分化途徑和機制與在體胚胎不完全相同，但在分子水平有共同或相似之處，是研究特定類型細胞分化、某些前體細胞起源和細胞譜系演變較理想的實驗體系；許多國家在法律上禁止以克隆或復制人為目的的前提下，已允許將人ES細胞類似于小鼠ES細胞體外實驗一樣，用于研究人類胚胎發育、分化和調節信號等事件。哺乳類發育的體外模型編輯ppt人體的基因和細胞治療這里的基因治療是指用遺傳改造過的人體細胞直接移植或輸入病人體內，到達控制和治愈疾病為目的的治療手段，又稱細胞治療。編輯ppt目前常說的基因治療技術雖然能把編碼正常序列的基因導入突變細胞而使突變基因的功能得到糾正，但導入基因的整合和表達難以精確控制，特別是基因插入后對其他基因產生的效應尚無法預知。更大問題是，許多被用作基因操作的細胞在體外不易穩定地被轉染和增殖傳代；ES細胞是基因治療的較理想的靶細胞，經遺傳操作后一般仍能穩定地在體外增殖傳代，克服了目前基因治療中需要大量靶細胞來源的主要問題。編輯ppt定向誘導分化，選擇治療因子基因表達

人ES細胞基因操作〔克服免疫學障礙〕

多種MHC組合的ES細胞庫組織譜系干細胞〔如造血干細胞〕功能性分化細胞〔如神經細胞〕移植移植

不同類型疾病的宿主

基因組被改造的ES細胞異源性基因表達基因修飾

基因敲除、敲入定向誘導分化選擇

組織譜系干細胞或功能性分化細胞移植圖2-2-1用于基因和細胞治療的人ES細胞工程示意圖根本策略1編輯ppt根本策略2欲接受細胞治療患者的體細胞核導入去核卵細胞體外發育胚泡期專用ES細胞特化細胞別離培養體外誘導分化回輸編輯ppt細胞治療的臨床應用前景神經系統疾病骨和軟骨疾病血液病肝病編輯ppt神經系統疾病

根據小鼠ES/EG細胞研究資料，由于各種類型神經細胞因某種原因死亡而成熟神經細胞又不能分裂、補充和替代死亡細胞引起的神經系統疾病如Parkinson’s疾病，Alzheimer’s病、多發性硬化癥等，有望通過人ES/EG細胞進行細胞治療。新近，產生多巴胺的神經細胞已能從小鼠ES細胞衍生而來，為細胞治療Parkinson’s病的ES細胞來源問題提供實驗依據。編輯ppt骨和軟骨疾病ES/EG細胞可能在體外被誘導為骨和軟骨，這些細胞被導入骨關節炎患者的關節軟骨損傷區域，或因骨折、手術而引起的較大骨隙中，這類從ES細胞衍生的骨和軟骨細胞在被移植部位自我修復的優點遠遠超過現行的組織移植。編輯ppt血液病ES和造血干細胞研究有助于產生供細胞移植用的、不含有鐮刀狀血球突變的血細胞。編輯ppt肝病利用肝干細胞移植治療肝病取得了重要進展。編輯ppt

組織工程的種子細胞來源人體ES細胞技術學的發生和開展，有望解決目前組織或器官修復中的難題。編輯ppt設想是選擇與人體細胞兼容性較好的生物材料，按缺損組織或器官的要求設計制成模型或支架放在體外培養系統中，使ES細胞或其定向誘導分化細胞沿著模型或支架不斷地生長擴增，構建成新的組織或器官。但ES細胞定向分化和構成組織和器官中細胞類型的復雜性等諸多問題尚待解決；目前工作是著重于從成年或幼年器官和組織的碎片中別離、培養和擴增某一類型的組織干細胞，經過體外培養擴增有可能作為組織工程的種子細胞來源。例如，從骨髓別離和擴增間質干細胞(mesenchymalstemcell,MSC)，用作骨折愈合、肌腱韌帶修復、肌肉再生和造血重建等組織工程的種子細胞。編輯ppt六、ES細胞研究面臨的問題和研究趨勢--如何解決用于人類胚胎干細胞研究的胚胎來源問題？--如何別離、純化干細胞？--如何保持體外培養胚胎干細胞的全能性，并控制定向誘導分化？--如何使ES細胞誘導分化產生的分化細胞永生化？--分化后的細胞是否有致瘤性？--如何使干細胞在體外發育成完整的器官？--如何克服分化細胞移植后仍有可能發生的免疫排斥？--有關倫理道德和法律以及商業應用等問題編輯ppt--改善ES細胞的體外培養條件，建立更有效、更簡便的獲得ES細胞的方法；--定向誘導分化成特定類型細胞，用于臨床疾病治療并解決免疫排斥和潛在的致腫瘤的問題；--成體干細胞的橫向分化的能力以及與胚胎干細胞的比較：成體干細胞能否替代胚胎干細胞？編輯ppt嵌合體一詞的英文是chimera，源于希臘神話，是指獅子頭、山羊身和蛇尾的雌性怪物。有關嵌合體神話在各國文化中都有嵌合體的科學概念那么是，任何由兩個或兩個以上遺傳上不同的組織構成的機體。它可以是任何不同物種的混合，但目前較關注的是動物與人的嵌合體。嵌合體與雜合體〔hybrid〕不同。雜合體是由來自不同物種的兩個配子形成一個合子。一個雜合體的所有細胞來源于這一合子。編輯ppt最近美國政府封殺了斯坦福大學的一項向小鼠大腦植入人類神經干細胞的研究，引起了國際學界和公眾的關注。這項研究是當前干細胞研究前沿的一個重要方面，涉及到一個機體擁有兩種不同物種的細胞或組織，這種嵌合體研究引起許多新穎的倫理問題，激發了對這類研究應該采取什么行動的倫理爭論。編輯ppt第一是為了建立動物模型。

例如世界上首次克隆牛的華裔美籍科學家楊向中創造了兔子的人類心臟病