1叢枝菌根試驗方案李曉林(1990)30μm不能排解外界微生物及澆灌施肥等措施造成的影響絲分別開來，使菌絲進入菌絲室，而將根阻擋在菌根室中，不讓二者混在一起，為深入爭論菌根菌絲的生理生化特性供給的技術和方法。Glomusintraradices44μm117μm77μm，呈橢球形或(4—1圖版I6)G．margarita孢子和S．sinuosa孢子果的萌發。雖然較前兩種孢子和孢子果的芽管數略少，但它仍很快。G．intraradices菌絲的分枝呈垂直方向。生成的菌絲較聯孢菌絲直徑更細，對根段進展侵染會更簡潔。9cm的培育皿底部，30μm的尼龍網黏貼在有機玻璃條及培育皿壁，直至培育皿上蓋，阻擋根的進入(圖4—2)。將轉移RiT—DNAG．intraradicesSchenck&Smith叢枝菌根真菌孢子，共同培育的室稱為菌根室(MC)(HC)4—2培育皿中的兩M10mL倒入菌根室中，用于離體雙重培育叢枝菌根真菌與轉移RiT—DNA胡蘿I-10mLNO-N3NH-N(N的含量與MpH4溴甲酚紫作為指示劑；②倒入10mL不含蔗糖的M培育基，pH5．5。在相應的菌根G．intraradicesM培育基上生長的轉移RiT—DNAi-根的5cm-7cmG．intraradices孢子直徑小，每個培育皿移進30個孢子。將培育皿在27℃±1℃的恒溫培育箱中黑暗培育。菌根室中共生聯合體生長狀況：G．intraradices菌根真菌相像于G．margarita菌根真菌，基質中形成了大量的養分孢子及成熟的孢子(圖4—3)。養分孢子的大小為4lμm-62μm49μm67μm93μm78μm。物質。質的雙向流淌有助于進一步探究菌絲對物質運輸的作用驅動力(Smith，1997)。孢子不僅是作為叢枝菌根真菌養分儲存的器官，更是一種穩定心法(李曉林、馮固，2001)。這些方法的共同點都是能夠將菌根孢子從生長基質中富積起來，但是孢子與基質的小顆粒特別是沙粒顏色相近，不易于區分。測定叢枝菌根孢子密度方法一：常規的濕篩傾析法(Gerdemann和Nieolson，1963)：(1)稱取肯定重量的土壤樣品，放在容器內用水浸泡20min-30min，盡量使土壤松散。假設(2μm一034μm面略微傾斜。(3)用玻璃棒攪動浸泡土壤的水溶液，停置幾秒鐘后，使大的石礫和雜物篩面的一個點上，避開整個篩面都沾有土壤溶液。(4)用清水依次輕輕沖洗停留在篩面(5)將濾液通過細篩并用水沖洗。在不同直徑的孢子。(6)將含有篩出物的培育皿放在雙目實體解剖顯微鏡下觀看并計數。測定叢枝菌根孢子密度方法二：濕篩傾析染色法(簡稱染色法)改進的濕篩傾析法，前4步驟同方法一。(5)用洗瓶將停留在篩面上的篩出物輕輕沖洗到一個清潔的試管內，滴90。C水浴鍋或烘箱中加熱半小時，進展染色。(6)將染色后的濾液通過細篩，并沖洗篩上的濾物，可洗去染色劑，將篩出物放在清潔的培育皿里。在的孢子。(7)將含有篩出物的培育皿放在雙目實體解剖顯微鏡下觀看并計數，可觀測到紫色孢子。兩種方法對菌根孢子的形態特性以及測定精度比較據。孢子在土壤中主要呈無色透亮、白色、淡黃、黃棕、棕色、金黃、紅棕和黑色等顏色(李曉林、馮固，2001)，很多孢子的顏色與基質沙土的顏色相近，在計數時不易被區分(5—1圖11—1)(5～2圖版Ⅱ一2)，通過濕篩傾析法篩選出的菌根孢子或多或少帶有菌絲，菌絲同時也被染色，與四周沙粒顏色反差較大，觀測孢子形態特性比較明顯，孢子的圖5—1濕篩傾析法觀測到孢子形態(棕黃色)5—2染色法觀測到的孢子形態(紫色)后的孢子(紫色)比沒染色的孢子(棕黃色)易于觀測，可以明顯地提高計數工作效率。以寧夏大武口煤矸石山接種菌根處理的沙土樣品為例來統計孢子密度，10g350個。而利用染色法來測定一樣樣品的380個。每個土壤樣品精度上平均提高了8％，染色法較常規的濕篩傾析為誤差，提高了孢子密度測定的精度，染色后的孢子(紫色)比沒染色的孢子(棕黃色)易品為例，本試驗條件下以傳統的濕篩傾析法來統計孢子密度，10g沙土樣品孢子數平均350380平均提高了8％，染色法較常規的濕篩傾析法更易于識別和識別，提高了孢子密度測定的精度。(350個孢子／10g)25min～30min1個樣品(380個孢子／10g)1個樣品縮(25min-30min)，本試驗40個土樣，在測定速度上節約1000min一大規模樣品的孢子密度監測供給了一種快速的方法種可行的快速測定方法。該方法與常規的濕篩傾析法相比，也存在缺乏，經過在90℃水浴鍋或烘箱里加熱30min染色后的孢子失去了活力變成了死孢子，孢子不能再發芽叢枝菌根的種類和活性，因而不適合用于收集活孢子。5．5小結(1)染色法對于陜速測定叢枝菌根孢子密度總量是可行的，精度較高，對于大批量樣品孢子密度的測定可行。(2)染色法缺乏之處是孢子經高溫加熱和染色，不同種或屬孢子不易于識別，活孢子數量不能夠統計準確。因此本方法不適合測定活性孢子密度統計。10-100g10-100m1500-1000ml水，攪拌，靜10s后過雙層分樣篩(20400目)。反復沖洗待測樣品并過篩3-4次，收集400目篩子上的殘留物于大離心管中3000／min離心3min4％50％的蔗糖，攪勻后快速放人離心機，1500r／min1．5min400目篩，再用。菌根侵染狀況觀看與侵染率測定：(1)活體鏡檢法：將要檢查的植物沉著器或田間輕輕發育狀況，并可節約植株。缺點是并不格外準確。(2)染色鏡檢法：為了準確檢查菌根發育狀況、測定侵染率，則需承受染色法。一般要經過根系透亮—染色—分色過程。具體FAA固定的根系剪成長0.5-1.0cm小段放人試管或其他染色容器，參加5％-10％KOH溶液，放在9020-60min，通常草本植物的幼嫩根系透亮時間較短，而木本植物的根系則較長。去掉堿液然后用自來水輕輕沖洗根系3次，2HCl5min。去掉酸液后參加酸性品紅(0．01％)乳酸甘油染色液(875ml63ml63ml0．1g)90℃水浴鍋內20-60min，或室溫下過夜?；厥杖旧嚎芍貜驮儆?。參加乳酸分色后即可鏡檢、如用乳酸酚翠盤藍(0．05％)染色液(300g250ml250ml300ml；翠盤藍(Trypanblue0．5g)則不必參加HCl酸化，可以直接染色，并可用水分色。植物細胞不著色(有時中柱著色)，真菌組織染成紅色(酸性品紅染色)或藍色(翠盤藍染色)用的有方格穿插法和根段頻率標準法(Biermann＆Lindermanl981)而準確的根段頻率標準法。該方法測定的結果在肯定程度上能反映出菌根侵染的程度。將經過上述染色處理的根樣，用鑷子和挑針選擇25條粗細全都的根段整齊地排列在干凈200下檢查每條根段的侵染狀況，依據每段根系菌根構造的多少按0，10，20，30，…100％的侵染數量給出每條根段的侵染率。例如，沒有菌根構造的根段其侵染率為0，假設100％，只有一半長度的根段被侵染形成菌根的則該根段的侵染率為50％，依此類推，并記錄各侵染率下根段的條數。依以下公式即可計算該樣品菌根的侵染率。另外，可利用目鏡測微尺測定單位根系長度泡囊、侵入點的數量。對于脂膠、五色指甲油等封固后可長期保存。叢枝菌根真菌的接種方法叢枝菌根真菌有多種接種方法當的接種方法然而不管承受何種方法操作人員和有關器具必需在接種前進展消毒處理，以盡量削減污染的時機。對需要接種處理的植物種子、根系培育植物用的各種容器和培育基質苗床和苗圃土壤等都要消毒甚至滅菌對于大田土壤有條件的最好也進行消毒處理。另外，必需留意，接種劑類型、接種物形式、劑量和接種方法的不同會直接影響(施亞琴等1993，Yineta1．1997)叢枝菌根真菌的接種效果一、按接種物形式區分的接種方法孢子接種法 即以叢枝菌根真菌的孢子作為接種物進展接種處理是常用的接種方法可先將孢子從菌劑中分別出來挑到濾紙上或放進盛有生理鹽水的小瓶中便可用來接種假設菌劑中只含有孢子可依據單位重量或單位體積孢子含量直接參加肯定重量或體積的菌劑。按孢子用量又可進一步分為：(1)單孢接種 即只挑一個孢子用來接種。通常用于菌種純化分別、分類鑒定等爭論目的事先在滅菌沙中播種煙草等寄主植物，培育至3—6片真葉，即可用于接種處理。解剖鏡下用毛細管把孢子直接放在幼苗根系上，然后將該苗定植于育苗器中，承受半水培法培育2—4周后一般即有菌根侵染。(2)雙孢接種 挑出兩個相像的孢子接種，類似于單孢接，但接種成功的時機大于單孢接種法。(3)多孢接種 即選擇外部形態全都的3個或多個孢子進展接種可以大大提高接種成功的時機但有時所接孢子可能不是來自一個種因此，該法不宜用來菌種純化、分別鑒定等工作。但可用于生理效應、生態等爭論工作，如一般每棵幼苗可接500—1000個孢子。2．根段接種法 將已充分形成菌根的根段(侵染率達80％以上，且含有較多泡囊)，剪成小碎段，可用作接種物。一般每個養分缽接種0．2—0．5g穎根段即可無論穎或風干的根段均可測定出接種勢單位數量。依據需要的接種勢單位數量，換算成根段長度或重量，即可接種。3．培育基質接種法是最常用的叢枝菌根真菌的接種方法。由于用石英砂、純潔的河沙、蛭石、沙土等作培育基質來生殖菌種。因此，這些培育基質中含有大量孢子、菌絲、菌根根段(和)孢子果等生殖體其接種勢較大且穎的接種物優于風干的用此培育基質接種物作菌劑，侵染成功率高速度快具體操作上可依上述方法測得單位重量或體積培育基質接種物的接種勢單位數量一般每個養分缽或每盆可分別參考施用5000或10000接種勢單位；對于苗圃或大田可按每m2為5X10*一5X10’接種勢單位的菌劑進展接種。二、按接種部位區分的接種方法1．對種子接種 是播種時或播種前對種子進展的接種處理。依據不同處理方式又可將其分為：①種子球衣化接種法種子球衣化是生產上常用的方法大體作法是將接種物粘合劑與種子一起經過球衣機加工使種子外表包圍一層均勻的接種劑，涼干后便可播種。此法本錢較高②拌種接種法：將接種劑與種子拌勻后再播種。2．對幼苗根系接種 對各種來源的組培苗、脫毒苗、少于6片真葉的生長在滅菌基質中的幼苗均可將接種劑直接放到根系上或根系四周此法菌根侵染速度較快，假設用穎的菌劑則侵染速度會更快。3．對容器接種 當前越來越多的經濟作物承受各種容器育苗如紙質或塑膜養分缽各種育苗器花盆等均常用來短期培育或栽培植物?？蓪⒕鷦┡c滅菌后的培育基質混勻裝入容器，然后播種或定植幼苗。也可先將滅菌后的培育基質裝入養分缽或育苗器中在培育基質上挖數個將接種劑放人穴內或將接種劑放在容器中部然后在培育基質外表播種此法的特點是因容器體積限定了根系的擴展范圍同時由于菌劑比較集中故有利于強迫侵染可以培育出優質菌根苗，當其侵染率達50％以上時，便可移栽到苗圃或大田中4。對苗床和苗圃接種 在苗床或苗圃基質或土壤上開溝然后將接種劑條播到溝內最終播種5．對大田接種 開溝后可將接種劑撒播到溝內，然后再播種，這樣可以削減接種劑用量。如地表撒播，然后耙入土內，接種物用量較多。國外已有用飛機撒播接種物，這在飛播造林上是常用的方法。三、其他接種方法1．大田直接定植養分缽接種法 將菌劑參加養分缽并播種后直接將其按肯定株行距定植到大田中這樣可以省去養分缽育苗過程由于菌劑被限制在養分缽內可以大大提高侵染速率和侵染強度從而增加接種菌根真菌的效果。2。多菌混合接種法 所謂多菌混合接種法是指同時將兩種或兩種以上叢枝菌根真菌的接種劑施加到要進展接種處理的土壤或植物上有時也指將叢枝菌根真菌與外生菌根真菌根瘤菌解磷或解鉀細菌其他生防細菌或真菌等同時混合接種，這是科研上針對不同試驗目的承受的方法。3。掩蓋作物接種法 即幼齡果園一般間作花生、大豆、地瓜、三葉草、玉米、小麥等。這些間作物都適合于叢枝菌根真菌的侵染。因此在果園間作作物播種同時接種菌根，生長肯定階段后可增加土壤中叢枝菌根真菌的數量削減土壤中病原物的數量從而改善建果園土壤中微生物區系組成和土壤安康狀況作物收獲后大局部根系保存于土壤中由于這些根系都形