實驗血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳

主講：肖貴榜實驗血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳

1實驗?zāi)康模赫莆昭宕姿崂w維薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)的一般原理和方法。熟悉血清蛋白組分定量方法，并確定血清中清蛋白與球蛋白的比值。實驗?zāi)康模?實驗試劑：1、巴比妥-巴比妥鈉緩沖液(pH=8.6，離子強度0.075)：稱取2.768g巴比妥和15.458g巴比妥

鈉,置于大燒杯中，加蒸餾水約600ml，稍加

熱溶解，冷卻后用蒸餾水定溶至1000ml。置4℃保存，備用。2、氨基黑10B：氨基黑10B0.5克,甲醇50ml,冰乙酸10ml,蒸餾水40ml。3、漂洗液：取無水乙醇45ml，冰乙酸5ml和蒸餾

水50ml，混勻置塞試劑瓶內(nèi)貯存。3、0.4N氫氧化鈉：稱取氫氧化鈉16.0g，蒸餾水

加至1000ml實驗試劑：1、巴比妥-巴比妥鈉緩沖液(pH=8.6，離子強度3氨基黑10B氨基黑10B,苯胺藍(lán)黑，酸性黑1,萘酚藍(lán)黑，酸性黑10B，AcidBlack1氨基黑10B氨基黑10B,苯胺藍(lán)黑，酸性黑1,萘酚藍(lán)黑，酸4實驗器材：1.電泳儀：為電泳提供直流電源。2.電泳槽：為電泳提供場所。多用有機玻璃制成，電極用鉑絲。3.血清加樣器：可用蓋玻片或X膠片或微量加樣器。4.醋酸纖維素薄膜：2cm×8cm5.其它：

培養(yǎng)皿（直徑9-10cm）、濾紙、玻璃板、鑷子等。DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀DYY-Ⅲ型電泳槽實驗器材：1.電泳儀：為電泳提供直流電源。DYY-5型穩(wěn)壓5一、電泳的原理電泳：帶電粒子在電場的作用下向著與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象。

實驗原理：一、電泳的原理電泳：帶電粒子在電場的作用下向著與其電性相反的6以蛋白質(zhì)為例：pH>pIpH=pIpH<pIH＋H＋OH－OH－蛋白質(zhì)兼性離子蛋白質(zhì)陽離子蛋白質(zhì)陰離子（等電點）以蛋白質(zhì)為例：pH>pI7人血清中幾種主要蛋白組分血清蛋白質(zhì)等電點分子量占總蛋白的％清蛋白4.6469,00057～72α1－球蛋白5.06200,0002～5α2－球蛋白5.06300,0004～9β－球蛋白5.1290,000～150,0006.5～12γ－球蛋白6.85～7.3156,000～950,00012～20

緩沖液pH=8.6

pI＜pH血清蛋白帶負(fù)電荷,在電場中向正極移動。人血清中幾種主要蛋白組分血清蛋白質(zhì)等電點8醋酸纖維素薄膜電泳它是用醋酸纖維薄膜作為支持物的電泳方法。醋酸纖維薄膜由二乙酸纖維素制成，具有均一的泡沫樣的結(jié)構(gòu)，厚度僅120mm。優(yōu)點：強滲透性，對分子移動阻力很弱，簡便、快速、樣品用量少、應(yīng)用范圍廣、分離清晰和沒有吸附現(xiàn)象。醋酸纖維素薄膜電泳它是用醋酸纖維薄膜作為9電泳速度:帶電粒子在電場中運動時，單位電場強度內(nèi)粒子運動的速度，以u表示，即

V—粒子運動的速度X—電場強度Q—粒子所帶電荷r—粒子的半徑η—介質(zhì)的粘度電泳速度:帶電粒子在電場中運動時，單位電場強度內(nèi)粒子運動的速10影響電泳速度的主要因素

1.樣品本身:

分子帶電量：Q越多，u越大；分子大小:分子小，r越小，u越大；

分子形狀：形狀越小，與支持物介質(zhì)摩擦 越小，u越大。球形分子>纖維狀分子影響電泳速度的主要因素

1.樣品本身:112.緩沖溶液：

A.pH值：(pH-pI)越大，Q越多，u越大B.離子強度(I)：離子強度代表所有類型的離子所產(chǎn)生的靜電力，也就是全部的離子效應(yīng)，它取決于離子電荷的總數(shù)，而與溶液中鹽類的性質(zhì)無關(guān)。溶液的離子強度越高，帶電質(zhì)點的泳動速度越慢；離子強度越低，質(zhì)點泳動的速度越快。

選擇離子強度時要兩者兼顧，一般離子強度的選擇范圍在0.02～0.2之間。2.緩沖溶液：A.pH值：(pH-pI)越大，Q越多，u越123.電場強度(X):

電場強度：電泳支持物上每厘米的電位降，也稱電勢梯度。

X越大，u越快。支持物越短，X越大，u越快。電場強度越大或支持物越短，電流將隨之增加，產(chǎn)熱也增加，影響分離效果。在進(jìn)行高壓電泳的時候必須用冷卻裝置，否則可引起蛋白質(zhì)等樣品發(fā)生熱變性而無法分離。3.電場強度(X):

電場強度：電泳支持物上每厘米的電位降，13依次分為清蛋白、α1、α2、β、γ球蛋白五個區(qū)帶

血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳5條區(qū)帶依次分為清蛋白、α1、α2、β、γ球蛋白五個區(qū)帶14二.定量操作膜條經(jīng)過氨基黑10B染色后顯出清晰色帶。各色帶蛋白質(zhì)含量與染料結(jié)合量基本成正比?？蓪⒏魃珟Ъ糸_，分別溶于堿性溶液中。用分光光度法計算各種蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。二.定量操作15實驗步驟：1．準(zhǔn)備與點樣：取兩條2.5×8cm的膜條充分浸透在巴比妥緩沖液中取出膜條濾紙吸去多余的緩沖液無光面距一端1.5cm處作點樣線點樣器下端粘上薄層血清垂直點樣實驗步驟：1．準(zhǔn)備與點樣：取兩條2.5×8cm的膜條充分浸透16點樣操作示意圖

點樣操作示意圖

172．電泳放置膜條點樣端置于陰極點樣面向下膜條貼緊濾紙，拉直膜條平衡5分鐘通電電壓：160v時間：60min關(guān)閉電源2．電泳放置點樣端置于陰極點樣面向下膜條貼平衡5通電壓：118電泳裝置電泳裝置193．染色、脫色通電完畢取出膜條浸于染色液（氨基黑10B）中3min取出膜條依次浸于漂洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各5min直至漂凈濾紙吸干薄膜3．染色、脫色通電取出浸于染色液（氨基黑10B）中3min取20預(yù)試結(jié)果圖（供參考）預(yù)試結(jié)果圖（供參考）21４.定量(兩人的膜條共用)取試管6支，編號1~6試管編號

Aα1α2βγ00.4mol/LNaOH4.0ml4.0ml4.0ml4.0ml4.0ml4.0ml蛋白條帶清蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白無蛋白區(qū)充分振蕩、脫凈染料比色、定量15min４.定量取試管6支，編號1~6試管編號A22實驗結(jié)果：各樣品吸光度值清蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白A1A2A3A儀器型號：吸收波長：儀器編號：650nm實驗結(jié)果：各樣品吸光度值清蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ23光密度總和

T＝A＋α1＋α2＋β＋γ1．計算出各部分蛋白質(zhì)占總蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。

清蛋白％＝（A/∑T）×100％

α1球蛋白％＝（α1

/∑T）×100％ α2球蛋白％＝（α2

/∑T）×100％ β球蛋白％＝（β/∑T）×100％ γ球蛋白％＝（γ/∑T）×100％2．計算出清蛋白與球蛋白之比值（A/G）

G=α1＋α2＋β＋γ光密度總和T＝A＋α1＋α2＋β＋γ1．計算出各部分蛋白質(zhì)24血清蛋白電泳結(jié)果的臨床意義可能相關(guān)疾病清蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白骨髓瘤↑*腎病綜合癥↓↑*↑*腎炎↑*↑肝硬化↓↑*急性肝壞死↓*↑↑↑↑傳染性肝炎↓↑*↑*急性感染初期↑*↑*↑*慢性炎癥/感染后期↑*低

球蛋白血癥↓*臨床上還可用A/G比來表示清球蛋白的量的關(guān)系：正常人A/G＝1.5～2.5血清蛋白電泳結(jié)果的臨床意義可能相關(guān)疾病清蛋白α1球蛋白α2球25注意事項：1、薄膜的浸潤與選膜是電泳成敗的關(guān)鍵之一。2、點樣時，應(yīng)將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，吸水量以不干不濕為宜。3、點樣時，動作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果。4、點樣后膜條的放置：區(qū)分電極正負(fù)極，膜條點樣端接于負(fù)極且點樣面向下。注意事項：1、薄膜的浸潤與選膜是電泳成敗的關(guān)鍵之一。265、點樣應(yīng)點在薄膜的毛面上，點樣量要適量，不宜過多或過少。6、