溫度、光照強度和ph對4株雨生紅球藻光合作用和生長繁殖速率的影響

雨生紅球藻（cysts）的厚壁酪氨酸（cysts）可獲得大量經濟價值很高的紅色素（astack）（grungetal.1992；李子，1991）。蝦青素在珍稀水產品[主要是鮭鱒魚類(Salmons)]養(yǎng)殖中被廣泛用作餌料添加劑,不僅具有很好的著色效果,可以改善產品的色澤和品質,而且能增強水產品對疾病的抵抗力(Toddetal,2000;Benemann,1992;Fossetal,1984;Kranzfelder,1994)。蝦青素的抗氧化能力強于β-胡蘿卜素和維生素E(Tero,1989;Miki,1991),被稱為“超級維生素”,具有潛在的醫(yī)用價值。利用雨生紅球藻大量生產蝦青素已成為國際上微藻生物技術研究的熱點之一。目前,國內外對雨生紅球藻的研究主要集中在兩個方面:(1)環(huán)境條件對雨生紅球藻生長繁殖的影響;(2)環(huán)境條件對雨生紅球藻孢子積累蝦青素的影響,以及人工誘導蝦青素的方法。在環(huán)境條件對雨生紅球藻生長繁殖的影響方面,各項研究在取得共識的同時也存在較大的分歧。溫度、光照、pH是影響微藻生長繁殖、生物量積累以及次生物質代謝的重要條件(王正方等,2001;顏天等,2002;劉建國等,2002)。關于最適溫度,Harker等(1995)報道雨生紅球藻的最適溫度為14—15℃;Lu等(1994)認為最適溫度為25—28℃,當環(huán)境溫度高于28℃則其生長受到抑制;Borowitzka等(1991)認為其生長溫度不能超過28℃,否則會促進膠群體細胞和靜孢子形成;而張京浦等(1997)研究認為溫度在33℃左右為宜。殷明焱等(1998)實驗結果證明20℃左右生長比較好,超過28℃細胞由游動變?yōu)椴粍印ｊP于最適光強,Boussiba等(1992)認為有利于其生長的光強為85—120μmol/(m2·s),最適光強為85μmol/(m2·s),當光強升到170μmol/(m2·s)時會有大量蝦青素積累;Lu等(1994)認為雨生紅球藻的飽和光強為90μmol/(m2·s),光強超過130μmol/(m2·s)則強烈抑制雨生紅球藻的生長;Harker等(1995)認為適合生長的光強范圍為50—60μmol/(m2·s),而對于蝦青素積累的最適光強為1600μmol/(m2·s)。后來Harker等(1996)又進一步研究表明低光強下[<37μmol/(m2·s)]雨生紅球藻細胞的成活率相當高,并且也能獲得高的生物量。金傳蔭等(1996)認為60μmol/(m2·s)的光強接近最適光強,但張京浦等(1997)認為光強控制在160—320μmol/(m2·s)對其生長有利。作者以4株雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)為材料,研究溫度、光照強度和pH對其光合作用和生長繁殖速率的影響,以期一方面了解它們的最適溫度、最適光強和最適pH,加深對雨生紅球藻生長繁殖與環(huán)境條件的關系的認識;另一方面通過比較4株雨生紅球藻光合作用特性以及對培養(yǎng)溫度適應性,為篩選適合于大量培養(yǎng)生產蝦青素的藻種以及大規(guī)模培養(yǎng)條件的優(yōu)化提供依據。1材料和方法1.1酶活劑Haematococcuspluvialis26、Haematococcuspluvialis30、Haematococcuspluvialis34和HaematococcuspluvialisWZ由中國科學院武漢植物研究所經濟微藻藻種庫提供。1.2培養(yǎng)基培養(yǎng)基為改良的BG11培養(yǎng)基。1.3繁殖條件4株雨生紅球藻藻種長期保存在溫度為(22±1)℃、光照強度為50μmol/(m2·s)的環(huán)境中,生長良好。1.4海藻溶液ph值的測量采用便攜式pHB-4型pH計(上海雷磁儀器廠)測定藻液的pH值。1.5海藻溶液od值的測定采用722型可見光分光計(上海第二分析儀器廠)在540nm波長下測定藻液的OD值,比色杯光徑為1cm。1.6光明強度的測量用LX-1332型照度計(日本三菱儀表)測定。1.7光合放氧速率法lbc采用本實驗室組裝的溶解氧測定系統(tǒng)測定藻液的凈光合速率。系統(tǒng)由具有溫度自動補償功能的RSS5100型便攜式溶解氧測定儀(上海雷磁儀器廠)、帶夾層的玻璃反應杯、磁力攪拌器、LKB2219multitempⅡ恒溫循環(huán)水浴(瑞典LKB)和6組熒光冷光源組成。光照強度調節(jié)范圍為0—800μmol/(m2·s);藻液在磁力攪拌器的作用下持續(xù)運動;直接讀取每分鐘溶解氧的變化值(mg/L),計算藻的凈光合放氧速率。測定光合放氧速率,通常采用μmolO2/(mgChl-a·h)為單位。本項研究的目的除了研究溫度、光照強度和pH對4株雨生紅球藻光合作用的影響,了解它們的最適溫度、光飽和點和最適pH外,還要比較4株雨生紅球藻在各自最適條件下的光合作用速率,為藻種篩選提供依據。由于4株雨生紅球藻的Chl-a占鮮重的比例差異非常大,為了進行相互比較,沒有采用μmolO2/(mgChl-a·h)為單位,而是以藻的鮮重為基礎計算光合作用速率,單位采用μmolO2/[mg(FW)·h],更能反映藻細胞光合作用的能力。1.8棄清液上清液法吸取一定體積的藻液,以4000r/min離心5min,棄去上清液。收集藻泥,先在55℃條件下烘干2h,再在105℃條件下烘干至恒重,精確稱量,計算每升藻液中藻的干重,按鮮藻含水量90%換算每升藻液中藻的鮮重。1.9光合速率測定離心收集處于對數(shù)生長期的藻,將藻液濃度調為OD540=0.3,在光照強度為100μmol/(m2·s)條件下,測定溫度為5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃時的單位時間內藻液溶解氧濃度的變化,計算凈光合速率,繪制光合速率隨溫度變化的曲線。凈光合速率{μmolO2/[mg(FW)·h]}=[ΔDO(mg/L)×1000]/[32×FW(mg/L)×t(h)]1.10光合速率測定離心收集處于對數(shù)生長期的藻,將藻液濃度調為OD540=0.3,在其最適溫度下,測定光照強度為60、100、150、200、250、300、400、600、800μmol/(m2·s)時單位時間內藻液溶解氧濃度的變化,計算凈光合速率,繪制光合速率隨光強變化的曲線,計算公式見1.9。1.11光合速率的測定離心收集處于對數(shù)生長期的藻,將藻液濃度調為OD540=0.3,將藻液的pH值分別調為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0,在黑暗中放置12h,然后在最適光照強度和最適溫度條件下,測定各個pH值時單位時間內藻液溶解氧濃度的變化,計算凈光合速率,繪制光合速率隨pH變化的曲線,計算公式見1.9。1.12溫度對藻液生長的影響以對數(shù)生長期的紅球藻為藻種重新接種,藻液密度為(0.5—1.0)×104個/ml,50ml的三角瓶放25ml藻液,每組二個重復,置于搖床上,搖床轉速為100r/min,連續(xù)光照,光照強度100μmol/(m2·s),溫度根據實驗要求分別設定為10℃、15℃、20℃、25℃、28℃。共培養(yǎng)5天,根據下列公式計算生長速率(μ):μ=(lnN2?lnN1)/(T2?T1)μ=(lnΝ2-lnΝ1)/(Τ2-Τ1)1.13光照強度和光照周期以對數(shù)生長期的紅球藻為藻種重新接種,接種密度為5.5×104/ml,50ml三角瓶裝25ml藻液,分為兩組,一組連續(xù)光照,光照強度為50μmol/(m2·s),另一組光暗周期為L∶D=12h∶12h。每隔24h取樣記數(shù),繪制生長曲線,計算生長速率,計算公式與1.12相同。2結果2.1光合放氧速率結果如表1所示。在實驗條件下,H.pluvialis26在5℃時光合放氧速率低,當溫度升高到15℃時,光合放氧速率達到最大值;在10—20℃范圍內,光合放氧速率基本保持穩(wěn)定;溫度超過20℃,光合放氧速率直線下降,35℃時,光合放氧速率只有最大值的1/5。H.pluvialis30的光合放氧速率變化與H.pluvialis26的基本相同,隨著溫度的升高,經歷了一個直線上升—基本穩(wěn)定—直線下降的過程,20℃時,光合放氧速率最大;35℃時,光合放氧速率只有最大值的1/4。H.pluvialis34在5—15℃范圍內,光合放氧速率直線上升,15℃時達到最大值;15—35℃范圍內,光合放氧速率直線下降,35℃時,光合放氧速率已成為負值。H.pluvialisWZ的光合放氧速率變化與H.pluvialis34的很相似,但是其光合放氧速率的最大值出現(xiàn)在10℃時,比其他3個藻種的溫度都低。2.2光飽和水溶液比結果如表2所示。在實驗條件下,4株雨生紅球藻的光合放氧速率隨光照強度變化具有非常相似的特征:在低光強時,光合放氧速率隨光照強度的增大而直線上升,當光強達到光飽和點,光合放氧速率達到最大值,光強超過光飽和點,光合放氧速率不再隨光照強度的增大而上升,而是基本保持穩(wěn)定。H.pluvialis26的光飽和點最高,為250μmol/(m2·s);H.pluvialis30和H.pluvialis34的光飽和點均為200μmol/(m2·s);H.pluvialisWZ的光飽和點最低,為150μmol/(m2·s)。2.3光合放氧速率隨時間的變化如表3所示,在實驗條件下,4株雨生紅球藻的光合放氧速率隨pH變化分為兩種類型:(1)隨著藻液pH值的上升,光合放氧速率經歷了一個上升—最大值—下降的過程;(2)隨著藻液pH值的上升,光合放氧速率持續(xù)下降。H.pluvialis26、H.pluvialis30和H.pluvialis34屬于第一種類型,H.pluvialisWZ屬于第二種類型。H.pluvialis26、H.pluvialis30和H.pluvialis34的最適pH值分別為8.0、8.0和7.0,H.pluvialisWZ的最大光合放氧速率出現(xiàn)在pH6.0處。當pH值達到12時,4株雨生紅球藻的光合放氧速率均降為負值。2.4培養(yǎng)生長速率H.pluvialis26、H.pluvialis30、H.pluvialis34和H.pluvialisWZ在不同溫度下培養(yǎng)的生長速率見表4,它們分別在20℃、25℃、20℃、15℃時生長繁殖最快。2.5胞密度和計數(shù)光暗周期對4株雨生紅球藻生長繁殖速率具有相似的影響。H.pluvialisWZ在連續(xù)光照和12h光照12h黑暗條件下培養(yǎng),細胞密度的變化見表5。H.pluvialisWZ在連續(xù)光照和12h∶12h光暗周期的條件下培養(yǎng),細胞數(shù)目的變化有顯著差異。經過4天的培養(yǎng),在連續(xù)光照下,每毫升藻液中的細胞數(shù)目增加了11.6×104;而在12h∶12h光暗周期條件下,每毫升藻液中的細胞數(shù)目僅增加了5.0×104,前者的增加量是后者的2倍多;對應的生長速率(μ)分別為0.284和0.162,前者是后者的1.75倍。3討論3.1適應低溫的品系實驗結果表明,溫度、光照、pH對雨生紅球藻光合作用有顯著的影響,不同的藻種(品系),光合作用的最適溫度、最適光強和最適pH不同。本實驗中所用的4個品系,H.pluvialis26、H.pluvialis30和H.pluvialis34的光合作用特性比較相似,而H.pluvialisWZ則顯著不同。H.pluvialis26、H.pluvialis30和H.pluvialis34在10—20℃范圍內,都表現(xiàn)出活躍的光合作用,屬于適應低溫的品系。H.pluvialisWZ的最適溫度為10℃,溫度超過10℃,光合放氧速率隨溫度的升高而幾乎直線下降,表現(xiàn)出對低溫特異的適應性,與迄今為止所報道的雨生紅球藻都不同。H.pluvialis26、H.pluvialis30和H.pluvialis34的最適pH為中性和弱堿性,與其他研究者的報道相同(邱保勝等,1999;Elliott,1934)。而H.pluvialisWZ的最適pH為弱酸性和中性,也是比較特殊的。除了光飽和點不同外,實驗所用的4個品系的光合放氧速率隨光照強度的變化具有基本相似的特征,值得注意的是,雖然4個品系的光飽和點都不高,但是,光強升高到光飽和點的4—5倍,光合放氧速率并沒有下降,即沒有出現(xiàn)高光抑制現(xiàn)象。根據這一點,作者推論,雨生紅球藻并不像普遍認為的那樣對高光敏感(劉建國等,2000),實際上具有較強的耐高光能力。3.2測定適合于不同品系的最適培養(yǎng)溫度雨生紅球藻生長繁殖速率隨培養(yǎng)溫度升高的變化與光合作用隨溫度的變化具有相同的趨勢,都經歷了上升—最大—下降的過程。光合作用的最適溫度低的品系,培養(yǎng)的最適溫度也低,反之亦然。有意思的是,4個雨生紅球藻品系的最適培養(yǎng)溫度都比其光合作用的最適溫度高5℃。現(xiàn)在還不清楚這一現(xiàn)象只是所研究的4個品系的巧合,還是雨生紅球藻的特性。從理論上分析,同一藻種(品系)的最適培養(yǎng)溫度與光合作用的最適溫度密切相關,光合作用表現(xiàn)出的溫度適應性反映生長繁殖對溫度的要求。所以,可以通過測定適合于光合作用的溫度來了解藻種(品系)適合的培養(yǎng)溫度。測定光合作用速率隨溫度的變化,方法簡便、省時、省力,可以快速地對大量樣品進行檢測。這一方法已經在作者的實驗室中成功地用于高溫和低溫螺旋藻品系的篩選。細胞數(shù)目的增加與光照時間成正比,表明雨生紅球藻不需要光暗周期變化。在培養(yǎng)中,為了使藻快速生長繁殖,大量積累生物量,增加光照時間是有效的手段。3.3有潛力的耐低溫藻種的篩選篩選適合于大量培養(yǎng)的雨生紅球藻,首先應該選光合放氧速率高,生長繁殖快的藻種。比較4個品系在各自的最適條件下的光合放氧速率和在不同溫度下培養(yǎng)的生長速率,除H.pluvialis34外,其余三個品系的表現(xiàn)都較好,并且各有特色。H.pluvialis34的光合放氧速率較低,特別是表1反映出其溫度適應范圍很窄,10℃時出現(xiàn)負增長,僅在15℃和20℃范圍內生長較快,溫度超過25℃,生長速率明顯下降,不適合作為大量培養(yǎng)的藻種。H.pluvialis26的適應范圍最廣,綜合表現(xiàn)最好,是一個有潛力的藻種。H.pluvialisWZ是一個特性鮮明的藻種,從其光合作用隨溫度變化的特性看,是一個特別適應于低溫的藻種。由于雨生紅球藻普遍適應于較低的培養(yǎng)溫度,最適溫度一般在20℃左右,為了進行大規(guī)模生產,篩選藻種的注意力一