1精選課件精漿生化檢驗2精選課件

一、精漿的來源及作用

二、精漿α-葡萄糖苷酶測定

三、精漿果糖測定

四、精子頂體酶的測定

五、其他生化項目測定3精選課件一、精漿的來源及作用男性生殖系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)外生殖器內(nèi)生殖器

—陰囊＋陰莖—生殖腺（睪丸）、輸送管道（附睪、輸精管、射精管和尿道）和附屬腺體（精囊、前列腺、尿道球腺）4精選課件

男性生殖腺分泌功能睪丸:精子、雄性激素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、附睪:中性α-葡萄糖苷酶、肉毒堿、甘油磷酸膽堿、唾液酸等，與精子的功能性成熟有關(guān)精囊腺:分泌果糖、前列腺素等，呈堿性前列腺:分泌酸性磷酸酶、檸檬酸、谷氨酸轉(zhuǎn)肽酶、PSA、鋅、鎂等，其分泌物呈酸性5精選課件精液的組成和來源精液是由精子和精漿組成的混合物精子產(chǎn)生于睪丸精漿產(chǎn)生于附睪、前列腺、精囊腺和尿道球腺等附屬腺體正常精液中精子占5%，精漿占95%在精漿中約30%來自前列腺，60%來自精囊腺，5-10%來自于附睪及尿道球腺6精選課件7精選課件正常精漿應具備精漿量≥2.0ml外觀和粘稠度都正常PH值7.2-7.8

精漿各項生化指標正常精液WBC＜1×106/ml細菌培養(yǎng)陰性或細菌計數(shù)＜1000/ml8精選課件精漿主要化學成分水:約占90%以上糖類:果糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖等蛋白質(zhì):白蛋白及非酶蛋白質(zhì)脂類:包括膽固醇、睪酮、前列腺素等酶蛋白:酸性磷酸酶、透明質(zhì)酸酶、糖苷酶、精素、纖溶酶原激活劑等9精選課件肽類激素：如FSH、LH、催乳素等胺類：如精胺、亞精胺、精胺素等氨基酸：如精氨酸、谷氨酸等20多鐘有機酸及有機堿：如檸檬酸、肉毒堿、甘油磷酸膽堿、乳酸等無機離子：鋅、鎂、鈣、銅、鉀、氯、鈉等10精選課件精漿的生理作用作為一種介質(zhì)把精子輸送到女性生殖道內(nèi)，為精子提供營養(yǎng)物質(zhì)參與精液的凝固和液化精漿組成一個適當?shù)膒H值和滲透壓環(huán)境，具有一定的緩沖能力，以適應精子活動的需要精漿中含有調(diào)節(jié)輸卵管及子宮活動的物質(zhì)，同時還含有使宮頸粘液水解的物質(zhì)。11精選課件精液的凝固與液化精液剛射出時為一粘性、略呈灰黃色的液體，射出后立即呈膠凍樣凝塊，5～20min后又會自動液化，并仍呈一定粘度。當精液射于陰道內(nèi)5min可以完全液化，比體外液化的時間為快12精選課件精液液化一旦形成，精子在此液狀環(huán)境中才開始有效的自由活動，且有充分活動力，可由陰道進入宮頸、子宮及輸卵管，最后與卵子結(jié)合而致孕。精囊（凝固酶）和前列腺（液化因子、PSA）在精液的凝固和液化過程中起重要作用13精選課件男性不育疾病中精漿生化指標的改變凝固液化PHα-糖苷酶果糖酸性磷酸酶檸檬酸副睪疾病正常正常急性>8慢性<7降低正常正常正常精囊缺如不正常

<7正常降低正常正常前列腺疾病正常不>8正常正常升高降低降低輸精管阻塞正常正常正常降低正常正常正常14精選課件精漿生化檢驗的目的精子功能指標：評價精子受孕能力用于男性生殖道炎癥的診斷了解副性腺功能確定梗阻性無精子癥及梗阻部位15精選課件男科實驗室開展的精漿生化項目精漿α-葡萄糖甘酶測定精漿果糖測定精漿酸性磷酸酶的測定精子頂體酶的測定精漿鋅的測定精漿乳酸脫氫酶X同工酶的測定精漿檸檬酸定量測定16精選課件二、精漿中性α-葡萄糖甘酶測定（酶法）

檢測目的主要是附睪分泌功能的指標，較左旋肉毒堿和甘油磷酸膽堿對附睪更敏感、更特異先天性副睪發(fā)育不良明顯降低、急慢性副睪炎降低

正常見于單純輸精管阻塞無精癥17精選課件原理P-硝基酚吡喃葡糖苷（底物）對硝基酚（產(chǎn)物）淡黃色物質(zhì)，在405nm波長有最大吸收峰加酸是抑制酸性α-葡萄糖甘酶，保護中性α-葡萄糖甘酶加酸α-葡糖苷酶Na2CO318精選課件試劑組成酸性抑制劑600μl×1瓶糖苷酶抑制劑（凍干粉）1瓶底物（凍干粉）2瓶終止液50ml×1瓶標準品（1~5）各2.5ml質(zhì)控液100μl×1瓶底物溶解液5ml×1瓶19精選課件實驗設(shè)備及用具酶標儀低速自動平衡離心機微量水平振蕩器水浴箱（37℃）精密移液器（加樣槍）0.5~20ul、50~200ul、100~500ul、200~1000ul石英定時鐘20精選課件實驗操作方法試劑準備糖苷酶抑制劑凍干粉以120μl蒸餾水溶解，4℃可使用20天，分裝保存-20℃可長期使用（切勿反復凍融）每瓶底物凍干粉以2.2ml底物溶解液充分溶解，分裝保存溶解后的底物液，4℃保存可用5天，-20℃保存可用數(shù)月（切勿反復凍融）21精選課件標本準備記錄受檢者一次射精的精液總量(ml)精液液化后以3000g離心10分鐘，保留精漿若樣本不能立即測定，可以Eppendorf管分裝精漿，-20℃保存待檢根據(jù)離心力計算離心速度公式N：離心速度Rcf：離心力R：離心半徑22精選課件操作方法質(zhì)控測定管質(zhì)控對照管標本測定管標本對照管酸性抑制劑（ul）————1010蒸餾水（ul）1010————質(zhì)控液（ul）55————樣本（ul）————55糖苷酶抑制劑（ul）——5——537℃預溫5min，底物同時預溫5min。底物（ul）10010010010037℃準確反應25min。終止液（ul）1000100010001000每管各取250ul，標準液250ul,在微孔板上按特定方法排列，酶標儀405nm比色。23精選課件比色與計算

計算標準管濃度對應的標本濃度值1單位（U）葡糖苷酶活性=37℃下每分鐘產(chǎn)生1umolPNP標本系數(shù)=總孵育體積÷樣本體積÷反應時間(min)=1115÷5÷25=8.92標準管濃度對應的標本濃度值(umol/L)=標準管實際濃度×8.9224精選課件標準管實際濃度（umol/l）輸入酶標儀程序時標準管濃度（U/L）000.54.4618.92217.84435.68

各標準管計算濃度如下25精選課件根據(jù)酶標儀功能選擇比色計算方式直接計算檢測樣本濃度（適用于可設(shè)置多樣本空白的酶標儀，如：BIO-TEKELx800系列等）方式：酶標儀可為每個測試孔（包括標準和待檢標本）設(shè)置空白，并自動完成每例ΔA的計算，然后根據(jù)ΔA擬合曲線，直接計算出檢測標本濃度26精選課件

各檢測孔在微孔板上的位置排列方式如下1234……AS1R3R3B……BS2R4R4B……CS3R5R5B……DS4R6R6B……ES5R7R7B……FQQBR8R8B……GR1R1BR9R9B……HR2R2B┇┇……S：標準孔Q：質(zhì)控孔QB：質(zhì)控對照孔R：標本測定孔RB：樣本對照孔27精選課件Bio-TekELx800酶標儀程序設(shè)置，主要參數(shù)如下MAPPINGDIRECTION:DOWN;BLANKMAP:P-DOWN;ENTERNUMBEROFSTANDARDS:05ENTERNUMBEROFSTANDARDREPLICATES:01CONCN.OFSTD1:0CONCN.OFSTD2:4.46CONCN.OFSTD3:8.92CONCN.OFSTD4:17.84CONCN.OFSTD5:35.68按“平滑曲線”方式擬合標準曲線酶標儀打印輸出結(jié)果，即為檢測標本真實濃度（U/L）28精選課件優(yōu)點

儀器可設(shè)置多樣本空白，直接計算待檢樣本濃度缺點

操作繁鎖（對酶標儀操作技術(shù)要求較高）浪費試劑每次試驗最好作標準曲線29精選課件通過人工計算檢測樣本濃度（適用于不能設(shè)置多樣本空白的酶標儀，如大多數(shù)普通酶標儀）酶標儀對空白處理方式有限，但可設(shè)置一個空白孔單孔，所有檢測孔吸光度均為之相減。30精選課件各檢測孔在微孔板上的位置排列方式如下：A

BR1R5

……BS1R1BR5B……CS2R2R6

……DS3R2BR6B……ES4R3R7

……FS5R3BR7B……GQR4R8

……HQBR4BR8B……1234……B：空白孔S：標準孔Q：質(zhì)控孔QB：質(zhì)控對照孔R：標本測定孔RB：樣本對照孔31精選課件設(shè)置酶標儀程序時，標準濃度輸入值分別為0、4.46、8.92、17.84和35.68。按“平滑曲線”方式擬合標準曲線人工計算方法：檢測管實際濃度(U/L)=檢測管濃度-對照管濃度。如：質(zhì)控管實際濃度=Q－QB標本1實際濃度=R1－R1B32精選課件結(jié)果報告

標本最終檢測結(jié)果以“精漿中性α-葡糖苷酶總活性”方式報告，即總活性=標本濃度(U/L)×一次射精的精液體積(ml)=mU/一次射精正常參考值≥20mU/一次射精（WHO）

33精選課件試驗中注意事項嚴格控制禁欲時間和樣本離心速度操作時加樣要準確，混勻充分底物液直接于37℃水浴狀態(tài)加入反應完畢迅速加入終止液每個樣本必須做樣本空白對照34精選課件掌握好溫度和孵育時間質(zhì)控液不能加酸性抑制劑比色前微孔板應進行充分振蕩（非常重要）糖苷酶抑制劑溶解后應迅速分裝，-20℃冷凍保存底物見光易分解，注意蔽光保存35精選課件

質(zhì)量控制目的評價精漿α-葡糖苷酶檢測中離心速度、禁欲時間、以及凍融對精漿α-葡糖苷酶水平的影響，為精漿α-葡糖苷酶檢測實現(xiàn)標準化及實驗室內(nèi)部和實驗室之間的質(zhì)量控制提供指導不同速度離心后的精漿中α-葡糖苷酶水平見表1、36精選課件表1精漿α-葡萄糖苷酶在精漿標本2000r/min離心10min和3500r/min離心15min結(jié)果比較組別nα-葡萄糖苷酶

(U/ml）精漿(2000r/minfor10minutes)5150.31±18.94精漿(3500r/minfor15minutes)5147.09±17.92*兩組結(jié)果比較*:P=0.00137精選課件不同速度離心后的精漿中精子密度的比較精液經(jīng)2000r/min離心10min后，84.31%（43/51）的精漿含有精子，平均精子密度為(2.43±3.95)×106/ml，而經(jīng)3500r/min離心15min后，23.53%（12/51）的精漿含有精子，平均精子密度為（0.22±0.87）×106/ml，結(jié)果見圖1。38精選課件圖1不同速度離心后的精漿中精子密度的比較05101520253015913172125293337414549例數(shù)精子密度(106/ml)Centrifugationat2000r/minfor10minutesCentrifugationat3500r/minfor15minutes39精選課件

凍融后的精漿α葡糖苷酶的檢測結(jié)果所有6份標本加與不加PMSF對α-葡糖苷性檢測沒有影響（P>0.05）。連續(xù)20天（隔一天檢測一次）的檢測結(jié)果表明，6份標本的CV為2.22%～5.29%。見表240精選課件表2精漿樣本在加入PMSF和未加入

PMSF后活性變化情況Samplen加入PMSFα-葡萄糖苷酶(U/ml)未加PMSFα-葡萄糖苷酶(U/ml)CV(%)11020.84±0.663.1721.23±0.683.2021023.01±1.054.5622.87±1.215.2931033.43±1.163.4733.78±0.752.2241036.54±1.744.7636.63±1.754.7851048.48±1.583.2649.04±1.673.4161055.98±1.753.1356.72±1.632.87CV(%)41精選課件不同速度離心后的精漿α-葡糖苷酶水平與禁欲時間的關(guān)系見表3、圖242精選課件表3精漿中α-葡萄糖苷酶在不同的禁欲期間離心

2000r/min10min或3500r/min15min結(jié)果比較2~3天比較,*:P<0.05;4~5天比較,#:P<0.05;6~7天比較,△:P<0.05禁欲時間(d)nα-葡萄糖苷酶(U/ml)精漿(2000r/min)精漿(3500r/min)2~31236.47±12.2434.04±11.224~51649.62±16.86*47.73±17.37*6~71451.14±19.76*46.76±17.70*>8968.70±14.10*#△63.86±13.63*#△43精選課件圖2

不同禁欲時間與α-葡萄糖苷酶活性相關(guān)系數(shù)A02040608010012005101520禁欲天數(shù)α-葡萄糖苷酶活性(U/ml)B02040608010012005101520禁欲天數(shù)α-葡萄糖苷酶活性(U/ml)標本離心2000r/min標本離心3500r/min44精選課件2000r/min離心后的精漿及3500r/min離心后的精漿中α-葡糖苷酶水平與禁欲時間之間的相關(guān)系數(shù)（r）分別為0.538和0.486(P均<0.001)。提示，隨著禁欲時間的延長，精漿α-葡糖苷酶水平不斷升高。45精選課件在精漿α-葡糖苷酶的檢測中，應該注意離心速度對結(jié)果的影響，要想得到單純的精漿，離心速度≥3500r/min，只有如此，各實驗室之間的檢測結(jié)果才具有可比性46精選課件精漿α-葡糖苷酶水平檢測的最佳禁欲時間最好為4～7天，即精漿α-葡糖苷酶檢測中禁欲時間亦應標準化，應規(guī)定為4～7天對α-葡糖苷酶活性檢測來說，冷藏精漿標本可作為不同實驗室之間的質(zhì)控品47精選課件果糖含量直接反映精囊分泌功能，間接反映睪丸間質(zhì)細胞分泌睪酮功能．結(jié)合α-葡糖苷酶用于判斷先天性輸精管精囊發(fā)育缺陷無精子癥和阻塞性無精子癥的判斷:如下表

三、精漿果糖的測定（酶法）量PH凝固睪丸輸精管果糖α-糖苷酶先天性輸精管精囊缺如少＜7不正常無無正常降低輸精管阻塞正常正常正常正常有正常降低無48精選課件試驗原理果糖5-酮基果糖甲替類化合物（淡黃色）其在490nm處有最大吸收峰，其顏色深淺與果糖含量成正比特異性酶脫氫遞氫體49精選課件試劑組成緩沖液酶液（凍干粉）顯色劑終止液酶液（凍干粉）溶解液果糖標準液標本稀釋液實驗設(shè)備及用具同α-葡萄糖苷酶測定50精選課件操作方法試劑準備每瓶酶液凍干粉加0.6ml酶干粉溶解液溶解，室溫溶解30min，待用溶解后的酶液4℃保存可用1月，分裝后-20℃保存至少可用1年（切勿反復凍融）臨用前配制工作液，方法是：緩沖液∶顯色劑=9∶1，充分混勻，待用51精選課件標本準備新鮮精液液化后，迅速取部分精液2000g離心10分鐘，留取精漿立即檢測或-20℃儲存待分析檢測前，將待檢精漿標本用樣本稀釋液1:4稀釋，充分混勻制備標準曲線將8mmol/L果糖標準液用樣本稀釋液稀釋為4、2和1mmol/L三個濃度52精選課件檢測步驟標準零管（S1）標準管(1,2,4,8mM)（S2~S5）

標準空白管（SB）測定管（R）標本對照管（RB）稀釋標本(ul)---1010標本稀釋液(ul)10----標準液(ul)-10---酶液(ul)1515-15-工作液(ul)200200200200200充分振蕩混勻，封片，37℃避光準確反應40min

去掉封板膜，每孔加終止液50ul，振蕩混勻。上酶標儀490nm比色53精選課件比色與計算標準管濃度對應的標本濃度值(mmol/L)=標準管實際濃度×4。各標準管計算結(jié)果如下標準管實際濃度（mmol/L）輸入酶標儀程序時標準管濃度（mmol/L）00142841683254精選課件直接計算檢測樣本濃度酶標儀同α-葡萄糖苷酶測定，只是多了一個標準空白孔人工計算檢測樣本濃度方法同α-葡萄糖苷酶結(jié)果報告方式報告：“μmol/一次射精”，一次射精果糖量(μmol)=精漿果糖濃度(mmol/L)×一次射精的精液總體積(ml)參考值：一次射精≥13μmol(WHO)55精選課件注意事項果糖標準液配好后4℃放2周后使用，期限約為2周即需更換（若為成品試劑盒應在1月內(nèi)用完）嚴格按要求留取精液標本精液液化后應立即離心將精子和精漿分開糜蛋白酶對精漿果糖檢測沒有明顯影響，不液化精液樣本，可預先加酶處理56精選課件離心速度對精漿果糖濃度的影響不大凍融對精漿果糖水平?jīng)]有明顯的影響，凍融精漿可以作為監(jiān)測不同實驗室果糖檢測的質(zhì)控品標本檢測結(jié)果出現(xiàn)極低值時，注意觀察樣本△A值和零標準△A值，結(jié)合標準曲線判斷57精選課件精漿果糖檢測標準化和管理果糖標準液吸光度的監(jiān)測果糖標準液連續(xù)監(jiān)測35天的OD值見圖1圖1果糖標準液OD值隨時間變化58精選課件精液放置時間對果糖濃度的影響48份精液標本液化后立即（0h組）、2h（2h組）和4h（4h組）后3500r/min離心15min分離精漿，所得果糖濃度見表159精選課件表21在精液0,2,和4小時液化過程中比較

精漿標本果糖含量（配對t檢驗）

組別n果糖(mg/ml)0h482.83±1.182h482.71±1.18*4h482.65±1.17#$0小時組比較,*:P=0.004,#:P=0.0002小時組比較,$:P=0.00660精選課件精液放置后果糖濃度的降低與精子濃度和活動率密切相關(guān)將每份標本0、2、4h的果糖值通過Excel作圖求出斜率（K），以代表每份精液標本果糖的降低速率將每份精子的活率乘以精子濃度得到活動精子濃度，再將兩者進行相關(guān)性分析r=0.374，P=0.009，提示精液果糖濃度降低與活動精子濃度呈顯著正相關(guān)，結(jié)果見圖261精選課件圖2精漿果糖濃度降低速率（K）

與活動精子濃度之間相關(guān)性01020304050607080-0.050.050.150.250.35斜率(K)活動精子濃度(106/ml)62精選課件檢測意義結(jié)構(gòu)：絲氨酸蛋白溶解酶，屬于膜結(jié)合性酶功能：水解卵細胞的透明帶及卵黃膜以達成一條通道，便于精-卵結(jié)合完成受精過程頂體酶活性可反映精子質(zhì)量，是判斷男性精子功能和生育力強弱的重要評價指標四、精子頂體酶活力的測定63精選課件試驗原理BAPNA硝酰基苯胺BAPNA:Nα-苯甲酰-DL-精胺酸-ρ-硝酰基苯胺（410nm)試劑抑制劑緩沖劑終止液底物液精氨酸酰胺酶64精選課件操作方法標本準備以清潔塑料容器盛精液標本，液化標本室溫可置3h，勿冷凍保存按每管參加反應的精子數(shù)為7.5×106個，根據(jù)標本精子濃度(M×106/ml)，計算實驗所需精液量vml（計算方法：v=7.5/M）試劑準備反應液臨用前配制底物﹢緩沖液﹦1﹕465精選課件操作方法測定管對照管抑制劑（ul）100100各反應管加蓋，以手指輕彈管底使沉淀精子均勻懸浮反應液（ul）10001000終止液（ul）10024℃準確孵育1h終止液（ul）1002000g離心15min0.5cm比色皿，410nm波長比色蒸餾水調(diào)零讀取OD值66精選課件結(jié)果計算單位定義在24℃，水解1.0∪molBAPNA／min的底物量定義為1IU頂體酶活性計算頂體酶活性(μIU/106精子)＝×106正常參考值48.2~218.7μIU/106精子495×7.5（測定管OD值—空白管OD值）×267精選課件檢測意義

升高前列腺肥大或早期前列腺癌降低前列腺炎試驗原理對硝基酚磷酸鹽對硝基酚黃色化合物，其顯色程度于405nm波長與標本酸性磷酸酶濃度成正比五、精漿酸性磷酸酶的檢測精漿酸性磷酸酶加酸加堿68精選課件標本準備記錄受檢者一次射精的精液總量(ml)。精液液化后不超過30分鐘，以3000g離心10分鐘，保留精漿若樣本不能立即測定，于Eppendorf管中加50ul精漿和50ulACP保存液，充分混勻。將精漿標本稀釋5000倍69精選課件比色及計算ACP國際單位（IU）：1單位酸性磷酸酶=37℃下每分鐘產(chǎn)生1umolPNP標本系數(shù)=總孵育體積÷樣本體積÷反應時間(min)×精漿稀釋倍數(shù)標準管濃度對應的標本濃度值(U/ml)=標準管實際