基于ITS2序列的海桐皮及其混偽品DNA分子鑒定

田榮，吳云，谷巍，單鳴秋，谷宇琛，馬麗杰，裴凌峰?藥材與資源?基于ITS2序列的海桐皮及其混偽品DNA分子鑒定田榮1，吳云2#，谷巍1*，單鳴秋1，谷宇琛1，馬麗杰1，裴凌峰11.南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇南京2100232.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇連云港222001應用ITS2條形碼技術，對海桐皮及其混偽品進行分子鑒定。通過提取31份海桐皮藥材基原植物刺桐、喬木刺桐及其混偽品的基因組DNA，擴增ITS2序列并測序；同時從GenBank下載混偽品序列15種38條，運用MEGA7.0軟件進行序列比對，進行種間序列差異分析比較，并構建Neighbor-jioning（NJ）系統(tǒng)進化樹，預測ITS2二級結構。在海桐皮2種基原中，刺桐的ITS2序列長度為232bp，喬木刺桐的ITS2序列長度為230bp，均為單倍型，可以明顯區(qū)分；同時與其他刺桐屬及易混品之間遺傳距離較遠。NJ樹結果顯示刺桐、喬木刺桐及其他易混品均單獨聚為一支，表現(xiàn)出良好的單系性；依據(jù)ITS2二級結構，刺桐、喬木刺桐及其混偽品在4個螺旋區(qū)的莖環(huán)數(shù)目、大小、位置以及螺旋發(fā)出時的角度均有明顯差異，可以直觀地將刺桐與喬木刺桐，以及其與易混品進行區(qū)分。ITS2序列作為DNA條形碼能穩(wěn)定、準確鑒別海桐皮藥材，為保障安全用藥提供了新的技術手段。海桐皮；刺桐；喬木刺桐；易混品；ITS2；物種鑒定海桐皮為豆科植物刺桐L.var.(L.)Merr.或喬木刺桐Roxb.的干燥樹皮。其味苦、辛，性平，具有祛風濕、通經絡、殺蟲等功效。主治風濕痹痛、痢疾、牙痛、疥癬。其也常用作抗菌劑、抗炎劑、退熱劑及防腐劑?[1]?；瘜W研究發(fā)現(xiàn)海桐皮所含主要次生代謝產物為生物堿、黃酮及異黃酮類化合物?[2]，其中黃酮及異黃酮類化合物有抗菌、抗炎、抑制Na?+/H?+交換系統(tǒng)活性及抑制磷脂酶A2的活性?[3]。海桐皮的提取物還具有抗腫瘤活性，可通過穩(wěn)定G-四鏈體結構，進而抑制端粒酶的活性，破壞腫瘤細胞的永生化，最終導致腫瘤細胞凋亡?[4]。本草考證表明海桐皮史載于《開寶本草》?！侗静輬D經》云：“海桐皮，出南海以南山谷，今雷州及近海州郡亦有之。葉如手大，作三花尖。皮梓白而堅韌，可做繩，入水不爛?！庇衷疲骸皫X南有刺桐，葉如梧桐，花側敷如掌，枝干有刺，花色深紅。”按植物形態(tài)描述及來源證明與今之海桐皮原植物刺桐相似，且從《本草綱目》《本草推新》《本草備要》的插圖也可以看出其為豆科刺桐屬植物。海桐皮藥材存在嚴重同名異物，藥用情況混亂、質量不可控的問題，且用藥混亂問題由來已久，混用品頗多，且都為不同科屬植物，如五加科植物刺楸(Thunb.)Koidz.的干燥樹皮（川桐皮），蕓香科植物椿葉花椒（食茱萸）Sieb.etZucc.和朵椒Rehd.的干燥樹皮（浙桐皮）等?[5]。同名藥材來源的多樣性容易混淆使用并使得臨床療效不確定。由于缺乏專業(yè)的鑒定人員，而從外觀上海桐皮與其他混偽品難以區(qū)分，容易造成混用。因此，亟待建立一種迅速、簡便有效的鑒定方法來區(qū)分海桐皮及其易混品以確保海桐皮種質、種源，保障臨床安全用藥。DNA條形碼是當前生物分類學的熱門技術，是利用一段有足夠變異的、易擴增且相對較短的標準DNA片段（500～1000bp）對物種進行快速、準確的自動鑒定。作為DNA候選序列的ITS2片段因其具有較強引物通用性、較高測序成功率以及足夠的序列變異性，而被大家廣泛關注?[6]。當前，國家藥典委員會討論通過在《中國藥典》增補本中列入中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則，該指導原則規(guī)定植物類藥材的DNA條形碼鑒定以ITS2序列為主，其鑒定能力也在藥用植物多個科屬基原植物及藥材的鑒定中得到了驗證?[7-13]。迄今，海桐皮基原刺桐和喬木刺桐的分子鑒定少見報道。本研究提取刺桐、喬木刺桐及易混品植物DNA并測定其ITS2序列進行分子鑒定，旨在為海桐皮藥材的快速準確鑒定及開發(fā)利用奠定基礎。1材料和儀器1.1材料2018年4～10月，從福建、廣東、貴州、云南、浙江省收集刺桐、喬木刺桐及其易混品樣品34份，均由南京中醫(yī)藥大學谷巍教授鑒定為刺桐var.L.、喬木刺桐Roxb.、雞冠刺桐L.、韓氏刺桐Verdc.、翅果刺桐(Hassk.)Merr.、龍牙花L.、蝙蝠刺桐Benth.、絨毛刺桐Willd.、乙狀刺桐Hua.、簕欓花椒(Lam.)DC.、楤木(Miq.)S(L.)Gaertn.、栓翅刺桐eem.、木棉L.、吉貝Roxb.、勁直刺桐Roxb.、塞內加爾刺桐DC.、刺楸(Thunb.)Koidz.、椿葉花椒Sied.et.Zucc.、大葉臭花椒Wall.exHook.f.、朵花椒Rehd.。其中編號4～6的刺桐樣品為藥材，其他樣品是采集植物樣品后，按地方標準《四川省中藥炮制規(guī)范》2015年版將樹皮加工為藥材。憑證樣本和數(shù)字影像信息保于南京中醫(yī)藥大學藥學院標本館，實驗材料信息及GenBank登錄號見表1。從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載了相關的ITS2序列共38條，信息見表1。1.2儀器與試劑Sigma3-18K高速冷凍離心機（Sigma公司，德國）；Compact水平蛋白電泳儀（Biometra公司，德國）；Bio-RadC1000PCR擴增儀（Bio-Rad公司，美國）；GelDocXR＋凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，德國）；DP316植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）、引物由上海捷瑞有限公司合成。2方法2.1DNA提取與PCR擴增及序列測定將藥材打粉，過80目篩，取100mg樣品，DNA的提取參照植物基因組DNA提取試劑盒操作步驟進行（水浴時間調整為60min）。（ITS2）序列擴增正向引物5’-ATGCGATACT-TGGTGTGAAT-3’；反向引物5’-GACGC-TTCTCCAGACTACAAT-3’。擴增體系（25μL）為10×PCRbuffer（無MgCl?2）2.5μL，MgCl?2（25mmol/L）2μL，dNTP2μL，正、反向引物各1μL，Taq酶0.25μL，模板2μL，雙蒸水14.25μL。ITS2序列擴增程序為94℃預變性5min，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，40個循環(huán)；72℃延伸10min。測序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成，每個樣本重復3次測序。表1材料產地及其ITS2序列信息續(xù)表1編號植物名單倍型序列長度/bpGC/%GenBank登錄號產地45木棉M123772.2DQ826447GenBank46吉貝N123068.7KM453169GenBank47N123068.7HQ658386GenBank48栓翅刺桐O123345.9JX856569GenBank49勁直刺桐P123962.3KR532088GenBank50塞內加爾刺桐Q122050.0KX057870GenBank51刺楸R123063.9MN422126江蘇南京52R123063.9MN422127江蘇南京53R123063.9MN422128江蘇南京54R123063.9MN422129遼寧丹東55R123063.9MN422130遼寧丹東56R123063.9AJ786228GenBank57R123063.9MG217641GenBank58R123063.9JQ048757GenBank59R123063.9JQ048756GenBank60R123063.9JQ048755GenBank61R223063.5AY256899GenBank62椿葉花椒T122469.2MN422131浙江舟山63T122469.2MN422132浙江舟山64T122469.2MN422133浙江舟山65T122469.2MN422134福建福州66T122469.2MH016477GenBank67T122469.2MH016478GenBank68大葉臭花椒S122472.8MG730220GenBank69S122472.8KP093220GenBank70S122472.8KP093219GenBank71S122472.8MG730221GenBank72朵花椒U122667.3MF039518GenBank2.2數(shù)據(jù)處理測序后所得峰圖采用CodonCodeAlignerV2.06（CodonCodeCo.，美國）校對拼接，去除低質量序列及引物區(qū)；使用基于隱馬爾可夫模型的HMM注釋方法?[14]，去除拼接得到的一致序列的兩端5.8S和28S區(qū)段?[15]（可將序列提交至http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de進行注釋），獲得標準ITS2間隔區(qū)序列。研究采用MEGA5.0軟件[16]比對所有序列，計算種內序列變異和種間序列變異，不同物種的單倍型為A1、B1，同一物種存在變異位點的單倍型為A1、A2，分析變異位點的信息確定不同的單倍型?[17]，采用相似性搜索法（BLAST1）和最小距離法（nearestdistance）?[18]考察ITS2序列的鑒定成功率，構建Neighbor-joining（NJ）系統(tǒng)進化樹評估各物種之間的親緣性。根據(jù)Koetschan等?[19]建立的ITS2數(shù)據(jù)庫及其網站預測ITS2二級結構。3結果與分析3.1海桐皮藥材及其易混品藥用植物PCR擴增效率及測序成功率對所有實驗樣本的ITS2序列分析發(fā)現(xiàn)，PCR擴增及測序成功率均為100%，序列獲得率（有效序列比例）亦為100%，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳得到PCR擴增電泳圖，擴增效果較好，條帶較亮，沒有拖尾現(xiàn)象。擴增序列長度范圍在450～550bp（圖1），除去5.8S和28SrRNA序列后，ITS2序列長度范圍在224～238bp，GC含量為47.0%～69.2%，平均GC含量為52.79%。M-Marker1～6-刺桐7～11-喬木刺桐12～15-雞冠刺桐16～18-韓氏刺桐19～23-翅果刺桐24～25-龍牙花26～30-刺揪31～34-椿葉花椒M-Marker1—6-var.7—11-12—15-16—18-19—23-24—25-26—30-31—34-圖1樣本的ITS2序列凝膠電泳圖Fig.1ElectrophoretogramofITS2sequencesofsamples3.2海桐皮藥材與其易混品的ITS2序列差異研究本實驗中各地采集的刺桐之間無變異位點，而與其易混品之間存在多個變異位點。刺桐不同來源的ITS2序列共6條，序列長度為232bp，ITS2序列的GC含量為50.4%，種內無變異位點，為單倍型，種內K2P遺傳距離為0；喬木刺桐ITS2序列長度為230bp，ITS2序列的GC含量為48.3%，種內無變異位點，為單倍型，種內K2P遺傳距離為0；說明刺桐及喬木刺桐種內ITS2序列高度保守。刺桐、喬木刺桐與海桐皮易混品的K2P距離為0.1251～0.9514、0.0637～0.9680，海桐皮2種基原種內最大遺傳距離均小于其與易混品的種間最小遺傳距離（表2），具有明顯的條形碼間距，說明K2P距離可很好地區(qū)分開海桐皮藥材及其易混品。實驗樣品中各物種ITS2序列，長度、GC含量見表1。將實驗數(shù)據(jù)和GenBank數(shù)據(jù)庫下載的數(shù)據(jù)結合，在更大樣本量下考察海桐皮藥材及其易混品的變異情況。結果表明，刺桐及喬木刺桐與其易混品的種間變異差異明顯，ITS2可以將其區(qū)分開，刺桐與喬木刺桐差異也較為明顯，可以加之區(qū)分。表2ITS2序列的種間差異和種內變異分析3.3海桐皮藥材與其易混品的ITS2序列變異位點分析3.3.1海桐皮藥用植物不同來源樣品種間變異分析通過對不同來源的6份刺桐樣品的ITS2序列分析，發(fā)現(xiàn)其ITS2序列無變異位點，為單倍型。喬木刺桐種內亦無變異位點，為單倍型；刺桐與喬木刺桐ITS2序列種間存在27個變異位點，可以明顯區(qū)分。3.3.2海桐皮易混品植物種內變異分析對海桐皮易混品之間進行種內變異統(tǒng)計分析，變異位點及單倍型統(tǒng)計見表3。雞冠刺桐種內為3個單倍型，存在2個變異位點；簕欓花椒種內為3個單倍型，存在2個變異位點；刺揪種內為2個單倍型，存在1個變異位點；翅果刺桐存在2個單倍型，有7個變異位點；龍牙花種內為2個單倍型，存在2個變異位點。3.4海桐皮藥材及其易混品ITS2序列分析采用BLAST和最近距離法對刺桐、喬木刺桐與其易混品進行鑒定研究，2種方法分析結果均表明ITS2序列可以準確地將海桐皮與其易混品之間鑒別開。為了更直觀地反映鑒定結果，本研究基于相似性搜索法和最近距離法結果構建了NJ系統(tǒng)聚類樹，bootstrap1000次重復，枝上數(shù)值僅顯示自展支持率≥50%。見圖2。結果表明，刺桐與喬木刺桐分別聚為一支，且互有區(qū)別。同時，與其他物種之間遺傳距離較遠，物種之間可以明顯區(qū)分。表3海桐皮易混品藥用植物種內變異分析bootstrap1000次重復，枝上數(shù)值僅顯示自展支持率≥50%3.5海桐皮藥材與其易混品ITS2序列二級結構根據(jù)Koetschan等[19]建立的ITS2數(shù)據(jù)庫及其網站預測刺桐、喬木刺桐與其易混品的ITS2二級結構（圖3），可以看出所有物種的二級結構均為一個中心環(huán)（主環(huán)）及4個螺旋區(qū)（helix）構成，每個螺旋上又有大大小小、或多或少的莖環(huán)（loop）結構。由于沒有參考模型，部分物種的ITS2序列的二級結構無法顯示。在同一物種中臂環(huán)的數(shù)量、大小和角度沒有顯著差異，但不同物種間存在顯著差異。通過比較海桐皮與其易混品的ITS2二級結構發(fā)現(xiàn)，各物種在4個螺旋區(qū)的莖環(huán)數(shù)目、大小、位置以及螺旋發(fā)出時的角度均有明顯差異，因此，依據(jù)ITS2二級結構，可以直觀地將刺桐、喬木刺桐與其易混品區(qū)分。圖3海桐皮及其易混品藥用植物ITS2序列的二級結構4討論DNA條形碼技術在物種鑒定以及相關領域的應用研究已成為現(xiàn)代生物學活躍的研究領域和新的熱點問題之一，也是未來物種鑒定的發(fā)展趨勢?[20-21]。同傳統(tǒng)中藥材的性狀、顯微、理化鑒定方法一樣，DNA條形碼鑒定技術的準確性和穩(wěn)定性也是業(yè)內研究的重點問題。所謂穩(wěn)定性是指不同產地、不同批次的樣品均能夠穩(wěn)定獲得DNA條形碼序列。中藥材因歷史淵源、民間習俗等原因，長期存在異藥同名的現(xiàn)象，加之中藥材市場的混亂，造成中藥材品種難以區(qū)別的現(xiàn)象。海桐皮為同名異藥的典型，各地均有該名稱藥材，而基原植物品種相差甚遠。無論是海桐皮、浙桐皮還是川桐皮均以樹皮入藥，難以從外觀上準確鑒定，尤其是對于非植物鑒定專業(yè)人員?[22]。因此，本研究從分子鑒定方法入手，建立了一種快速鑒定海桐皮基原植物的方法。本實驗分析海桐皮及其易混品藥用植物樣品的ITS2序列，結果顯示所有實驗樣本的PCR擴增、測序成功率及序列獲得率為100%，PCR產物均經過電泳檢測，并有清晰明亮條帶，說明ITS2在海桐皮的鑒定中是有效的DNA區(qū)段，ITS2序列引物及其反應條件針對海桐皮藥用植物穩(wěn)定性較好。在對藥材樣品進行DNA提取時，需要增大樣品量，同時延長水浴時間，可以提取得到較高質量的DNA。海桐皮2種基原種內最大遺傳距離均小于其與易混品的種間最小遺傳距離，具有明顯的條形碼間距，說明海桐皮及其易混品之間在分子水平上存在的差異是明顯的，通過K2P距離可很好地區(qū)分開。同時，在基于NJ法構建的系統(tǒng)聚類樹中，不同物種單獨聚為一小支，呈現(xiàn)出良好的單系性，ITS2二級結構所揭示的分子形態(tài)學特征也直觀顯示出海桐皮與其混偽品的明顯差異。依據(jù)ITS2二級結構，海桐皮與其混偽品在4個螺旋區(qū)的莖環(huán)數(shù)目、大小、位置以及螺旋發(fā)出時的角度均有明顯差異，可以直觀地將海桐皮與易混品區(qū)分。因此，作為DNA條形碼的ITS2序列能夠準確、簡便地鑒定海桐皮及其易混品藥用植物，為海桐皮的鑒別提供了新的分子鑒定方法，保證了海桐皮臨床選擇用藥的準確安全。DNA條形碼技術可以直接從基因水平提供鑒定依據(jù)，將有助于非分類學專業(yè)工作者對中藥藥用植物進行快速、準確地鑒定，是傳統(tǒng)鑒定方法的補充和拓展，具較好的推廣和應用價值?[23-24]。本研究結果分析了DNA條形碼技術應用于藥用植物鑒定中的問題，證明了ITS2序列作為DNA條形碼能穩(wěn)定、準確鑒別海桐皮藥用植物，為實際生產中確認藥材基原植物，為保障臨床安全用藥提供有效手段。志謝：貴陽中醫(yī)學院藥學院孫慶文、福建中醫(yī)藥大學藥學院楊成梓、安徽中醫(yī)藥高等?？茖W校李林華、遼寧中醫(yī)藥大學藥學院許亮、江蘇省中醫(yī)院藥學部朱育鳳主任、中國科學院植物研究所吳寶成、南京中醫(yī)藥大學翰林學院李琳等在實驗樣品采集過程中提供的幫助。利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突[1]田月琴.海桐皮質量標準及藥效學研究[D].太原:山西醫(yī)科大學,2014.[2]趙浩恩,金傳山,許鳳清.刺桐屬植物的生物堿類成分及藥理作用的研究進展[J].廣州化工,2018,46(09):13-16.[3]徐宇,郭禮躍,梁江,等.基于生信分析對國醫(yī)大師劉尚義痹證藥對豨薟草、海桐皮治療骨關節(jié)炎靶基因的預測研究[J].風濕病與關節(jié)炎,2018,7(10):10-14.[4]張虹,向俊鋒,譚莉,等.海桐皮提取物的抗腫瘤活性及其機制研究[J].藥學學報,2009,44(12):1359-1363.[5]張俊紅.中藥合歡皮、秦皮和海桐皮的鑒別分析[J].世界最新醫(yī)學信息文摘,2016,16(25):161.[6]KekkonenM,HebertPDN.DNAbarcode-baseddelineationofputativespecies:Efficientstartfortaxonomicworkflows[J].,2014,14(4):706-715.[7]RenFM,WangYW,XuZC,.DNAbarcodingof,themosttaxonomicallycomplicatedgenusofPapaveraceae[J].,2019,9(4):1934-1945.[8]ZhuS,LiQW,ChenSC,.Phylogeneticanalysisofspeciesbasedoninternaltranscribedspacer(ITS)regionandITS2secondarystructure[J].,2018,56(1):548-558.[9]HanJP,ShiLC,LiMH,.RelationshipbetweenDNAbarcodingandchemicalclassificationofL.medicinalherbs[J].,2009,75(4):268-275.[10]TahirA,HussainF,AhmedN,.AssessinguniversalityofDNAbarcodingingeographicallyisolatedselecteddesertmedicinalspeciesofFabaceaeandPoaceae[J].,2018,6:e4499.[11]GuW,SongJY,CaoY,.ApplicationoftheITS2regionforbarcodingmedicinalplantsofSelaginellaceaeinPteridophyta[J].,2013,8(6):e67818.[12]SunXQ,ZhuYJ,GuoJL,.DNAbarcodingtheinChina,avitalgroupintheevolutionofmonocotyledon:UseofmatKgeneforspeciesdiscrimination[J].,2012,7(2):e32057.[13]PangXH,SongJY,ZhuYJ,.ApplyingplantDNAbarcodesforRosaceaespeciesidentification[J].,2011,27(2):165-170.[14]MeiQX,ChenXL,XiangL,.DNAbarcodeforidentifyingfromcounterfeits[J].,2016,39(9):1531-1537.[15]KellerA,SchleicherT,SchultzJ,.5.8S-28SrRNAinteractionandHMM-basedITS2annotation[J].,2009,430(1/2):50-57.[16]KumarS,StecherG,TamuraK.MEGA7:Molecularevolutionarygeneticsanalysisversion7.0forbiggerdatasets[J].,2016,33(7):1870-1874.[17]劉琪,谷巍,楊兵,等.基于ITS2序列的濱海白首烏及其近緣種DNA分子鑒定[J].中草藥,2018,49(24):5901-5909.[18]ChenSL,YaoH,HanJP,.ValidationoftheITS2regionasanovelDNAbarcodeforidentifyingmedicinalplantspecies[J].,2010,5(1):e8613.[19]KoetschanC,HacklT,MüllerT,.ITS2DatabaseIV:Interactivetaxonsamplingforinternaltranscribedspacer2basedphylogenies[J].,2012,63(3):585-588.[20]黃建峰,李朗,李捷.樟屬植物ITS序列多態(tài)性分析[J].植物學報,2016,51(5):609-619.[21]AnkenbrandMJ,KellerA,WolfM,.ITS2databaseV:TwiceAsmuch:Table1[J].,2015,32(11):3030-3032.[22]田月琴,劉銳玲,李飛飛,等.海桐皮及其易混品的比較鑒別[J].光明中醫(yī),2014,29(12):2530-2533.[23]方強強,王燕,彭春,等.中藥DNA條形碼分子鑒定技術的應用與展望[J].中國實驗方劑學雜志,2018,24(22):197-205.[24]任夢云,杜樂山,陳彥君,等.鎖陽ITS序列遺傳多樣性分析[J].植物學報,2018,53(3):313-321.MolecularidentificationofCortexanditsadulterantsbasedonITS2sequenceTIANRong1,WUYun2,GUWei1,SHANMing-qiu1,GUYu-chen1,MALi-jie1,PEILing-feng11.SchoolofPharmacy,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China2.JiangsuKanionPharmaceuticalCo.,Ltd.,Lianyungang222001,ChinaITS2barcodingwasusedtodiscriminateanditsadulterantsinordertoprovideanewmethodfortheidentificationof.ThetotalgenomicDNAswereextractedfrom31samplesofvar.,.anditsadulterants.TheITS2sequencesofthesesampleswereamplifiedandbidirectionalsequencedbyPCR.TheobtainedsequencesweresubmittedtotheGenBankandtheITS2sequencesof38samplesbelongingto15speciesweredownloadedfromtheGenBank.Geneticdistance,neighborjoining(NJ)phylogenetictreeandsecondarystructuresofITS2sequenceswereanalyzedbyusingMEGA7.0.We