瘧疾檢驗技術第1頁，課件共56頁，創作于2023年2月●分子生物學、血清學技術發展迅猛,但是確診瘧疾的“金標準”

仍然是血液顯微鏡檢查●顯微鏡檢查是唯一可鑒別4種瘧原蟲的方法●厚薄血涂片的檢查仍被認為是不可替代的瘧疾診斷的金標準實驗室技術第2頁，課件共56頁，創作于2023年2月厚薄血膜的制作

血片制作在制作血片前，首先要核對患者的姓名、年齡和住址第3頁，課件共56頁，創作于2023年2月取血部位和血量采血部位和取血方法：耳垂或無名指，通常在耳垂取血，先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指緊捏耳垂上方或無名指指尖，右手持消毒針迅速刺入皮膚，不宜過深或過淺。然后用右手中指輕輕擠壓出血。厚血膜血量約一粒米大小。第4頁，課件共56頁，創作于2023年2月厚血膜用推片的一角，從取血部位刮取約4微升血量（相當于火柴頭大小），使血滴與平置的載玻片接觸，再由里向外一個方向旋轉，轉2~4圈，涂成直徑0.8~1厘米大小圓形厚血膜。薄血膜再取一小滴血.將血置于第一張玻片離厚血膜適當遠的地方.將采血玻片(推片)的邊緣緊貼載玻片使血液沿邊緣散開(如圖示).第5頁，課件共56頁，創作于2023年2月正確的推片姿勢第6頁，課件共56頁，創作于2023年2月標準的瘧疾厚薄血膜片位置第7頁，課件共56頁，創作于2023年2月各種不同的瘧疾血片涂制法：標準血片門診發熱病人血片居民普查血片第8頁，課件共56頁，創作于2023年2月厚薄血膜的標準

●厚血膜血量適宜，不宜過多或過少●薄血膜平整,無皺折和空泡.紅細胞單層排列第9頁，課件共56頁，創作于2023年2月血片染色

兩種染色方法:●吉氏染色法●瑞氏染色法

常用吉氏染色法第10頁，課件共56頁，創作于2023年2月吉氏染液(原液)的配置

吉氏染粉(AzureBtype)5g

甘油(純)250ml

甲醇

(純)250ml吉氏粉放入研缽中，加少量甘油充分研磨,

然后邊加邊磨，直至甘油加完，將研磨的染液倒入棕色瓶中，在研缽中加入少許甲醇清洗研缽，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，反復數次，直至甲醇用完。蓋好瓶蓋，將染液充分搖勻，置于室內，每天晃動數分鐘，存放一周后經過濾即可使用。保存時間越長染色效果越好。整個染色液配制時間不能少于5個小時第11頁，課件共56頁，創作于2023年2月稀釋吉氏原液●原液需經pH7.0鹽酸緩沖液（PBS）或凈水稀釋后，方可用于厚薄血片染色。

●吸取母液時，不要晃動瓶子,以免沉淀物泛起影響染色效果.第12頁，課件共56頁，創作于2023年2月操作1（快染）

配制5%染液，（每張血片約需染液2ml）：量筒內量2ml緩沖液或凈水，直接滴加吉氏原液7滴，混勻，滴入待染標本的厚薄血膜上，染色10min，清水細緩沖洗，晾干鏡檢。操作2(慢染)在染色量筒內量2ml蒸餾水或凈水，再滴加吉氏原液4滴，混勻，滴入待染標本上，染色30~40min。清水細緩沖洗，晾干鏡檢。吉氏染液濃度門診染色第13頁，課件共56頁，創作于2023年2月將已用甲醇固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染液稀釋液（3毫升吉氏原液加緩沖液或凈水97毫升，混勻）浸沒血片，同時對厚薄血膜染色30min（根據當地實際情況，酌情增減染色時間和濃度），然后用清水輕輕將染液漂洗干凈，將血片標本（血膜面朝下）插于晾干板上晾干，包裝，鏡檢。成批血片染色第14頁，課件共56頁，創作于2023年2月質量好的染色:

核呈紅色,胞漿呈藍色

如果血片偏紅,說明染液偏酸性如果血片偏藍,說明染液偏鹼性外觀吉氏染色血片第15頁，課件共56頁，創作于2023年2月染色過程將血片平置于染色板上。用吸管吸取已稀釋的吉氏液約2ml于厚薄血膜上，染色10min。用清水細緩沖去染液。置玻片于插板上，自然晾干。血片干燥后,用甲醇固定薄血膜。第16頁，課件共56頁，創作于2023年2月血片制作與染色注意事項

●使用前載玻片一定要清潔，不然會影響血片制作和鏡檢結果．●厚血膜干燥時不要加熱，加熱會使原蟲變形，影響鏡檢結果．●配置母液時過濾可除去雜質顆粒，有助于提高鏡檢質量．●固定薄血膜時不要將甲醇觸碰到厚血膜●沖洗染液時，不要沖走厚血膜。第17頁，課件共56頁，創作于2023年2月原蟲密度計算估計瘧原蟲感染程度有三種方法：●半定量計數法檢查厚血膜●白細胞原蟲密度計數法檢查厚血膜●紅細胞感染率計算法檢查薄血膜第18頁，課件共56頁，創作于2023年2月用厚血膜每個視野中所觀察到瘧原蟲的平均數粗略地估計出瘧原蟲密度。這種方法簡便，缺點是計數的瘧原蟲數受血膜厚薄影響，只能定性，不宜作定量分析。國內常用。此方法將密度分為6級：1.全厚血膜查見瘧原蟲數在10個以內，記錄實際數字2.全厚血膜查見瘧原蟲數在10個以上，但平均每個視野不到1個蟲，記錄“少”3.平均每個視野1~5個蟲，記錄“＋”4.平均每個視野6~10個蟲，記錄“++”5.平均每個視野11~100個蟲，記錄“+++”6.平均每個視野100個蟲以上，記錄“++++”。半定量計數法第19頁，課件共56頁，創作于2023年2月白細胞瘧原蟲密度計數法（WHO推薦）白細胞瘧原蟲密度計數法重要性●用于瘧疾研究●用于臨床診斷●用于抗瘧后瘧疾考核第20頁，課件共56頁，創作于2023年2月●在厚血膜，按要求選擇視野，計數200個白細胞中的瘧原蟲數（可分有性體和無性體），如果原蟲密度較低，可增加白細胞計數（500~1000個）。●白細胞瘧原蟲計算公式：瘧原蟲數×患者每微升血的白細胞數÷計數的白細胞數=瘧原蟲數/μl血。●如果不知患者的白細胞數，則每微升血以8000個白細胞計數(國際標準)。白細胞瘧原蟲密度計數法（WHO推薦）第21頁，課件共56頁，創作于2023年2月白細胞瘧原蟲計數法舉例●假設計數200WBC中有35個瘧原蟲，在不知患者白細胞數的情況下，以每微升血8000個白細胞為數,由此計算出每微升血液瘧原蟲密度為：35（原蟲數）x8000÷200（白細胞數）=1400/μl答：該患者原蟲密度為1400/μl。第22頁，課件共56頁，創作于2023年2月薄血膜不同區域的紅細胞瘧原蟲感染率有較大差別，通常血膜后端和邊緣部瘧原蟲密度常比前半部或中央部高，所以，鏡檢時不宜只檢查一個角落，應順玻片的橫軸檢查。鏡檢時，應當記錄下所觀察到的各種瘧原蟲蟲期，不要籠統地記錄為Pv或Pf。紅細胞感染率計算法（薄血膜）第23頁，課件共56頁，創作于2023年2月1.按以下公式計算：紅細胞原蟲感染率（%）=瘧原蟲數X100÷計數的紅細胞數2.顯微鏡下選擇紅細胞排列整齊密集，無重迭的視野（300-500紅細胞/視野）3.按一定順序移動血片記數紅細胞的同時，記錄瘧原蟲數4.如果能見到瘧原蟲，但是記數5000～10000個紅細胞時卻沒有感染紅細胞，那么設定感染率為＜１％

紅細胞感染率計算法（薄血膜）第24頁，課件共56頁，創作于2023年2月如何確定瘧原蟲血片為陰性●檢查全部厚血膜未查見瘧原蟲●

最少檢查100個厚血膜油鏡視野未查見瘧原蟲第25頁，課件共56頁，創作于2023年2月人類四種瘧原蟲的

基本特征第26頁，課件共56頁，創作于2023年2月感染人的瘧原蟲有四種:

惡性瘧原蟲P.falciparum

間日瘧原蟲P.vivax三日瘧原蟲P.malariae

卵形瘧原蟲P.ovale

第27頁，課件共56頁，創作于2023年2月惡性瘧

P.falciparum

●

四種瘧原蟲中致病力最強●

無免疫力者感染后出現急性癥狀,不及時治療可危及生命●

在我國主要流行云南省和海南省

第28頁，課件共56頁，創作于2023年2月間日瘧

P.vivax

●間日瘧原蟲分布于我國大部分地區，主要是中部地區●引起間日瘧,病程呈良性,但有復發

第29頁，課件共56頁，創作于2023年2月三日瘧P.malariae

●三日瘧在我國已基本消滅●主要發生在晚秋及初冬,無復發卵形瘧P.ovale●又稱蛋形瘧原蟲,在我國已基本消滅●引起癥狀與間日瘧相似,但很少復發第30頁，課件共56頁，創作于2023年2月四種瘧原蟲的

診斷要點

第31頁，課件共56頁，創作于2023年2月環狀體釬細,紅細胞不漲大一個紅細胞內可有幾個環狀體環狀體內可有2個核

環狀體可貼在紅細胞邊緣

血片中沒有其他發育期滋養體配子體呈新月形或臘腸形可出現茂氏點惡性瘧（P.falciparum）鑒定要點第32頁，課件共56頁，創作于2023年2月紅細胞通常漲大薛氏點明顯成熟環狀體粗大滋養體有阿米巴樣偽足可見不同發育期的原蟲

間日瘧（P.vivax）鑒定要點第33頁，課件共56頁，創作于2023年2月環狀體可呈方形帶狀形是特點成熟滋養體呈菊花狀,內含6～12個裂殖子紅細胞不漲大，略縮小有時有西門氏點

三日瘧（P.malariae）診斷要點第34頁，課件共56頁，創作于2023年2月卵形瘧（P.ovale）診斷要點紅細胞略漲大或不變大

紅細胞邊緣呈車輪狀環狀體有時呈現魚眼狀薛氏點明顯成熟滋養體類似三日瘧原蟲,但更粗大原蟲呈卵圓形

第35頁，課件共56頁，創作于2023年2月薄血膜中瘧原蟲寄生時

紅細胞的變化間日瘧原蟲三日瘧原蟲惡性瘧原蟲卵形瘧原蟲漲大,色淺淡,略變形可見薛氏點(除早期環狀體時)多重感染少見瘧色素黃褐色,散在,呈小桿狀正常,或略小正常染色時點彩不明顯多重感染少見色素見于早期,黑色顆粒狀,多見于細胞周圍正常大小常見多重感染一些細胞呈黃色邊緣較厚過度染色時茂氏點明顯瘧色素顆粒較粗新月形配子體外紅細胞膜見不到感染紅細胞略漲大或不變大通常呈卵圓形感染紅細胞邊緣破碎狀薛氏點明顯瘧色素棕黃色,類似間日瘧原蟲第36頁，課件共56頁，創作于2023年2月種周圍血中發育階段紅細胞形態瘧原蟲形態大小點彩胞漿瘧色素裂殖子數惡性瘧原蟲環狀體配子體正常常見茂氏點環狀體釬細，常見２個核粗黑，配子體中明顯16-32

間日瘧原蟲各期滋養體裂殖體和配子體漲大,可達正常的1.5-2倍薛氏點可出現阿米巴樣滋養體，淺藍色，活潑金棕色不明顯12-24

卵形瘧原蟲各期滋養體裂殖體漲大,可達正常的

1.25-1.5倍薛氏點可出現卵圓形滋養體，藍色較深，核較大深棕色明顯4-12三日瘧原蟲各期滋養體裂殖體和配子體正常西門氏點少見圓形，藍色深，核緊縮，滋養體帶狀深棕色，粗明顯6-12呈菊花狀第37頁，課件共56頁，創作于2023年2月鏡檢示教以下血片采自現癥病例第38頁，課件共56頁，創作于2023年2月Thisisathinfilmfroma27yearoldfemalebackpacker,witharecenthistoryoftrekkingthroughNorthernThailandandhighfever.

AtypicalPlasmodiumfalciparumpresentation.●Numerousfineringforms●Doublechromatindots●Marginalforms●Redcellsarenotenlarged第39頁，課件共56頁，創作于2023年2月Athinfilmfroma22yearoldmaleholidayinginLombok(Indonesia)onemonthpreviously.Intermittentfeverssincereturning.AtypicalPlasmodiumvivaxpresentation●Salientfeaturesare:●Developingandthick(signet)ringforms●Enlargedredcells第40頁，課件共56頁，創作于2023年2月RecenttravelinAfrica.Pyrexiaofunknownorigin.

AtypicalPlasmodiumovalepresentation●Developingformofplasmodium●Comet-like"redcells●Enlargedredcell第41頁，課件共56頁，創作于2023年2月Femalepatient,arrivedfromBraziltwoweekspreviously.Flulikesymptomssincearrival.AtypicalPlasmodiummalariaepresentation●Broadbandformofplasmodium●Redcellsnotenlarged第42頁，課件共56頁，創作于2023年2月Thisisathickfilmpreparedfroma32yearoldmalerecentlyreturnedfromVietnam.NumerousringformofPlasmodiumcanbeseen(asindicatedbythearrows).Notesizeofneutrophils(forcomparison).TheonlydefinitivediagnosisthatcanbemadefromthisfilmisthatMalariaispresent.Thinfilmswouldhavetobeexaminedforspeciesidentification.第43頁，課件共56頁，創作于2023年2月讀片練習第44頁，課件共56頁，創作于2023年2月2.Intermittentfever;arrivedfromIndia2monthsago.第45頁，課件共56頁，創作于2023年2月3.HistoryofroundtheworldsafariincludingS.America,AsiaandAfrica.Generalmalaise.第46頁，課件共56頁，創作于2023年2月4.Unspecifiedoverseastravel.Presentedwithtemperature38.4C第47頁，課件共56頁，創作于2023年2月5.MalerecentlyreturnedtoAustraliaafterbackpackingthroughAsia.Historyofflulikesymptoms.第48頁，課件共