紙片擴散法藥敏試驗操作程序目的規范紙片擴散法（K-B法）藥敏試驗標準操作程序，確保藥敏結果準確。原理將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種待檢菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸取瓊脂中的水分溶解后會不斷地向紙片周圍區域擴散，形成遞減的梯度濃度，在紙片周圍抑菌濃度范圍內待檢菌的生長被抑制，從而產生透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映待檢菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥物對待檢菌的最低抑菌濃度（MIC）呈負相關，即抑菌圈越大，MIC越小。設備、材料和試劑設備、材料恒溫培養箱、比濁儀、0.45%NaCl、一次性使用拭子、無菌醫用棉簽、游標卡尺、鑷子藥敏紙片藥敏紙片為直徑6mm、吸水量為0.02ml的商品化專用藥敏紙片（OXOID）；紙片需密封貯存于-20℃冰箱內；開封后的紙片與干燥劑一起置2℃-8℃冰箱保存；每次使用前先室溫平衡1-2h，以避免開啟貯存容器時產生冷凝水。培養基自配或購買的水解酪蛋白（Mueller-Hinton，M-H）培養基是CLSI推薦的兼性厭氧菌和需氧菌藥敏試驗標準培養基，PH為7.2-7.4。接種菌量比濁標準菌液濃度為1.5×108/ml，相當于0.5麥氏單位標準。菌懸液制備制備接種菌液：臨床標本分離的細菌或標準菌株做藥敏試驗時，應挑取已分純的菌落4-5個制備菌懸液。直接菌落法：用一次性拭子挑取生長在無選擇性瓊脂平板上新鮮菌落，懸浮于0.45%生理鹽水中，混勻后，采用比濁儀調整濁度至0.5麥氏濁度。肉湯增菌法：將單個菌落接種至肉湯培養基，置于35℃孵育，采用比濁儀調整濁度至0.5麥氏濁度（通常孵育2-6h）。實驗方法常用在檢測菌或標準菌株平板上挑取培養18~24h的純菌落均勻溶解于3ml0.45%無菌生理鹽水中，調校濃度至0.5麥氏單位；校正后的菌液應在15min內接種。接種用無菌醫用棉簽蘸取調好的菌液，在試管內壁將多余的菌液旋轉擠去后在瓊脂表面均勻涂布接種3次，每次旋轉平板60°，最后沿平板邊緣涂抹1周，校正濃度后的菌液在15min內接種完畢。貼紙片接種好的藥敏平板在室溫下放置3~5min用無菌鑷子將藥敏紙片貼于平板表面，并用鑷尖輕壓一下紙片，使其貼平。每張紙片的間距不小于24mm，紙片的中心距平板的邊緣不小于15mm，紙片貼上后不可再移動，因為抗菌藥物會立即自動擴散到培養基內。直徑90mm的平板宜貼6張藥敏紙片。貼上紙片后，須在15min內倒置平板，并放35℃孵箱培養。孵育接種好的平板放置35℃孵育18~24h（苛養菌的藥敏試驗需放35℃、5%CO2環境），平板在孵育箱內最好單獨擺放，不超過兩個疊在一起，否則中間的平板達不到孵箱溫度而產生預擴散的作用。對于某些特殊抗菌藥物如苯唑西林或萬古霉素，孵育時間需延長至24h。結果判讀用游標卡尺測量抑菌圈直徑（抑菌圈的邊緣應是無明顯細菌生長的區域），測量時應將平板置于黑色背景下，肉眼判讀；測量有些抗菌藥物的抑菌圈量時需要將平板對著光，如萬古霉素、利奈唑胺和苯唑西林等；由于培養基中可能存在拮抗劑，甲氧芐啶和磺胺類藥物抑菌圈內可允許出現菌株輕微生長，因此，在測量抑菌圈直徑時，可忽視輕微生長（20%或較少菌苔生長）而測量較明顯抑制的邊緣。藥敏試驗結果報告方式包括：“敏感”、“劑量依賴性敏感”、“中介”、“耐藥”和“非敏感”等。敏感（S）：當抗菌藥物對分離株的MIC值或抑菌圈直徑處于敏感范圍時，使用推薦劑量進行治療，該藥在感染部位通常達到的濃度可抑制被測菌的生長，臨床治療可能有效。中介（I)：當菌株的MIC值或抑菌圈直徑處于中介時，該數值接近藥物在血液和組織中達到的濃度，從而治療反應率低于敏感菌群。該分類意味著采用高于常規劑量治療時或在藥物生理濃集的部位，臨床治療可能有效。該分類同樣可作為“緩沖域”，以防止由微小、不可控的技術因素導致的重大偏差，尤其是毒性范圍較窄的藥物。劑量依賴性敏感（SDD）；細菌菌株對抗菌藥物的敏感性依賴于抗菌藥物的劑量。當某種藥物對菌株的MIC或抑菌圈直徑在SDD范圍時，臨床可通過提高劑量和（或）增加給藥頻率等修正給藥方案以達到臨床療效。耐藥（R):當抗菌藥物對分離株的MIC值或抑菌圈直徑處于該分類范圍時，使用常規治療方案，該藥在感染部位所達到的藥物濃度不能抑制細菌的生長，和（或）被測菌株獲得特殊耐藥機制，且治療性研究顯示該藥臨床療效不確切。非敏感（NS）：對于那些因未見或罕見耐藥，而僅具有敏感折點的抗菌藥物，當該藥對某分離株的MIC值高于或抑菌圈直徑低于敏感折點時，此分類為非敏感。常見各類病原體檢測藥物（K-B法）：儀器法的補充腸桿菌科：當對碳青酶烯類抗菌藥物耐藥時，需要對亞胺培南、美羅培南用紙片法重新驗證結果。變形桿菌屬：亞胺培南、阿莫西林/克拉維酸。普羅威登斯菌屬：阿莫西林/克拉維酸、亞胺培南。摩根菌屬：亞胺培南、頭孢吡肟。粘質沙雷菌：亞胺培南、哌拉西林/他唑巴坦。少見的“矛盾”耐藥表型應復核：左氧氟沙星耐藥、環丙沙星敏感；二代頭孢菌素敏感、三和四代頭孢菌素耐藥；碳青酶希類耐藥、頭孢菌素敏感；β內酰胺酶復合藥耐藥、頭孢菌素敏感。蜂房哈夫尼亞菌：頭孢吡肟。非發酵科銅綠假單胞菌：氨曲南、哌拉西林/他唑巴坦、當左氧氟沙星敏感、環丙沙星耐藥時、當頭孢吡肟MIC8ug/ml或16ug/ml時。粘液型銅綠假單胞菌：哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶、頭孢吡肟、亞胺培南、美羅培南、頭孢哌酮/舒巴坦、左氧氟沙星、阿米卡星、環丙沙星、妥布霉素、慶大霉素、氨曲南；48小時量抑菌圈直徑。不動桿菌屬：阿米卡星、米諾環素以及當左氧氟沙星耐藥、環丙沙星敏感時。嗜麥芽窄食單胞菌：米諾環素、左氧氟沙星、復方新諾明、美羅培南、亞胺培南。洋蔥伯克霍爾德菌：米諾環素、頭孢他啶、復方新諾明、美羅培南、亞胺培南。氣單胞菌屬：亞胺培南、美羅培南。卡他莫拉菌：阿莫西林/克拉維酸。流感嗜血桿菌：氨芐西林敏感，頭孢呋辛、頭孢克洛、氨芐西林/舒巴坦耐藥，要進一步復核、阿莫西林/克拉維酸。注意事項肉眼觀察時平板應保持在反射光照明的非反射黑的背景上方處進行，在抑菌環邊緣需借助放大鏡才能觀察到的微小菌落生長可忽略不計。測試鏈球菌時應測量生長受抑制區域而不是溶血受抑制區域。有的菌株如變形桿菌可出現蔓延生長，在抑菌環內出現淡淡云霧樣生長，還有甲氧芐啶和磺胺類藥物在抑菌環內允許出現輕微生長（20%或較少菌苔），可忽略不計，應以外圈為準。在抑菌環內有獨立生長的菌落，提示可能是混合菌或同一菌株中的耐藥菌，需要重新分離鑒定和藥敏試驗。被檢菌如為鮑曼不動桿菌，在含阿米卡星紙片周圍出現細菌生長環，而在此之外又出現抑菌環，即所謂雙環現象，應視為耐藥。質量控制質量控制是保證藥敏試驗結果準確性的前提。實驗室采用ATCC25922、ATCC27853、ATCC35218對常有抗菌藥物進行質量控制。質控頻率參考CLSⅠ細菌相關藥敏試驗操作及判斷標準,選擇藥敏質控標準菌株和藥物。連續檢測20一30天,每一組藥物/細菌的抑菌圈直徑或最低抑菌濃度(MIC)超出參考范圍的頻率應不超過(≤)1/20或3/30;也可采用替代質控方案,即連續5天,每天對每一組藥物/細菌重復測定3次,每次單獨制備接種物,15個數據中超出參考范圍(抑菌圈直徑或MIC)的結果應不超過(≤)1個,若失控結果為2-3個,則如前述,再進行5天,每天3次重復試驗,30個數據失控結果應不超過(≤)3個在不失控的時候可以每周做1次質控菌株的測定。如果發現有失控的情況，就必須每日做1次，尋找失控原因并予以糾正。如果連續30日失控＜=3次的，可以恢復每周1次。生物安全藥物性廢棄物可混合在感染性廢棄物里進行高壓滅菌后銷毀，并做好相關記錄。支持文件周庭銀、王華梁.臨床微生物檢驗標準化操作規程.1版.上海.上海科學技術出版社:2019.中華人民共和國衛生行業標準.抗菌藥物敏感性試驗的技術要求.中華人民共和國國家衛生健康委員會，2019.尚紅.王毓三.申子瑜.全國臨床檢驗操作規程.4版.北京.人民衛生出版:2015.中國合格