海藻酸鈉固定化α淀粉酶的研究卷,期】2023052023【總頁數】5頁5845-5849【關鍵詞】海藻酸鈉;固定化;α-淀粉酶;聚乙二醇【作者】鄭璐;雷明科;張瑞;吳元欣【單位】華中農業高校農業微生物學國家重點試驗室,武漢430070;武漢工程高校化工與制藥學院,武漢430074;武漢工程高校化工與制藥學院,武漢430074;華中農業高校農業微生物學國家重點試驗室,武漢430070;武漢工程高校化工與制藥學院,武漢430074【正文語種】中文【中圖分類】;925+.1α-淀粉酶α-1,4--葡萄糖-葡萄糖苷水解酶普遍存在于動物、植物和微生物中,它能以隨機作用的方式切斷淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子內的α-1,4葡萄糖苷鍵,產生麥芽糖、低聚糖和葡萄糖等,被廣泛應用于食品加工、糧食工業、乙醇工業、發酵和紡織業等多種行業,是工業生產中應用最為廣泛的酶制劑之一[1,2]。

固定化酶與游離酶相比,具有熱穩定性高、保存穩定性好、對變性劑耐受性強等優點,可重復或連續使用,且易于與產品分別,是食品、醫藥、化工等領域的討論熱點之一[3,4]。

依據酶的性質和用途,酶的固定化方法主要可以分為以下4種:吸附法、交聯法、包埋法和共價結合法[5]。

酶的固定化可以使用多種載體,其中海藻酸鈉是一種從海藻中提取的親水性膠態多聚糖,它是由β-1,4--甘露糖醛酸和α-1,4--古羅糖醛酸組成的線性高分子化合物,其分子含有自由的羧基和羥基,可溶于不同溫度的水中,生物相容性好,穩定、無毒、成膜性或成球性好,是常用的囊材與載體材料,也常被用作固定化酶的載體[6]。

聚乙二醇是一種無毒的高分子聚合物,與水有極好的互溶性,它的相對分子質量可從幾千到幾萬,掌握其相對分子質量的大小以及用量,可調整海藻酸鈣中孔的尺寸、體積和密度[7]。

以聚乙二醇為海藻酸鈉制孔劑,兩者在水溶液中形成均一體系,將兩者混入***化鈣溶液中時,海藻酸鈉轉化為交聯的網狀大分子,海藻酸鈣形成固態,聚乙二醇可以從固態的海藻酸鈣中溶出,即形成多孔結構的海藻酸鈣。

當聚乙二醇相對分子質量為4000時,海藻酸鈣支架中可形成蓬松勻稱的多孔結構,適用于組織工程多孔材料的應用[8]。

本試驗采納海藻酸鈉包埋交聯法制備固定化α-淀粉酶,得到最佳的固定效果,并對游離酶和固定化酶的酶學性質進行了比較。

采納聚乙二醇作為制孔劑,為進一步提高固定化α-淀粉酶的酶活性,提高α-淀粉酶的酶學性能供應參考。

1材料與方法儀器與材料試驗于2023年5月在武漢工程高校完成。

204型電子分析天平;722型可見分光光度計上海精密科學儀器有限公司;81-1型加熱磁力攪拌器上海司樂儀器廠;-300型多用途水浴恒溫振蕩器江蘇太倉市試驗設備廠;-22型電熱恒溫水浴鍋上海精宏試驗設備有限公司。

試驗中使用的α-淀粉酶購自北京雙旋微生物培育基制品廠;聚乙二醇4000購自公司。

其余試劑均購自中國醫藥集團上海化學試劑公司。

試劑純度均為分析純。

方法淀粉溶液多糖含量標準曲線的繪制用法標定淀粉溶液中的多糖含量[9]。

分別取40、60、80、100、120μ2%淀粉溶液,下同,計算多糖含量,稀碘液,用蒸餾水定容至10,混合勻稱后在600波長下比色。

以吸光度值為縱坐標,對應多糖含量為橫坐標,繪制標準曲線并列出線性回歸方程。

α-淀粉酶的固定化取44%海藻酸鈉溶液,下同,12%羧***纖維素鈉以下簡稱溶液,下同,22%α-淀粉酶溶液,用蒸餾水定容至10,置于磁力攪拌器上混合勻稱,用5注射器吸取上述混合液,以10%戊二醛的2%***化鈣溶液,下同中,固定后濾出小球,用蒸餾水洗滌2~3次,儲存于4℃冰箱中備用[10]。

α-淀粉酶活力的測定以200μ2%淀粉溶液為底物,加入100μ的1醋酸-醋酸鈉緩沖液,400μ蒸餾水,300μ適當稀釋的α-淀粉酶溶液,于60℃水浴鍋中精確?????反應15,馬上加入鹽酸終止反應。

反應液,加稀碘液,用蒸餾水定容至,混合勻稱后在600波長下比色。

固定化酶的活力測定方法是將上述方法中適當稀釋的α-淀粉酶溶液替換為肯定量的固定化α-淀粉酶。

在60℃、,以每反應15消耗1多糖的酶量為一個酶活力單位。

酶的相對酶活是指在同一組試驗中,以活性最高的一組為100,其余的酶活力與之相比,計算百分數。

單因素試驗以固定化酶的相對酶活為考察指標,探討海藻酸鈉濃度、酶濃度、***化鈣濃度、濃度對固定化酶活性的影響。

①不同濃度海藻酸鈉對固定化酶活性的影響。

%,濃度為%,***化鈣濃度為2%,固定,考察不同濃度的海藻酸鈉%、%、%、%對固定化酶活性的影響。

②不同濃度酶對固定化酶活性及固定效率的影響。

當海藻酸鈉濃度為2%,濃度為%,***化鈣濃度為2%,固定,考察不同濃度的酶%、%、%、%對固定化酶活性的影響。

③不同濃度***化鈣對固定化酶活性的影響。

%,海藻酸鈉濃度為2%,濃度為%,固定,考察不同濃度***化鈣1%、2%、4%、8%對固定化酶活性的影響。

④不同濃度對固定化酶活性的影響。

%,海藻酸鈉濃度為2%,***化鈣濃度為2%,,考察不同濃度0、%、%、%、%對固定化酶活性的影響。

正交試驗在單因素試驗基礎上,以酶濃度、***化鈣濃度、濃度、海藻酸鈉濃度4個因素進行934正交試驗,以獲得最佳固定條件,試驗因素與水平見表1。

表1正交試驗因素和水平單位:%因素水平***化鈣濃度123酶濃度123濃度數據分析采納-5軟件分析固定化酶的直徑。

2結果與分析固定化α-淀粉酶的單因素試驗不同濃度海藻酸鈉對固定化酶活性的影響分別取濃度為%、%、%、%的海藻酸鈉溶液進行試驗,結果見圖1。

由圖1可知,%時,固定化酶活性最大,當海藻酸鈉濃度連續增大時,固定化酶活性有所下降,其黏度增大,難以擠壓成球狀,并且所形成的凝膠小球體積過大,影響酶與底物充分結合。

由圖2可知,4種不同濃度海藻酸鈉固定化酶的平均直徑分別為、、、,即當海藻酸鈉濃度漸漸增大時,固定化酶小球的直徑隨之增大。

產生這一現象的緣由在于當海藻酸鈉濃度增大時,單位體積中能與鈣離子結合的位點數量也相應增加,進而得到直徑較大的固定化酶小球。

圖1不同濃度海藻酸鈉對固定化酶活性的影響圖2不同濃度海藻酸鈉對固定化酶形態的影響不同濃度酶對固定化酶活性及固定效率的影響分別取濃度為%、%、%、%的酶液進行試驗,結果見圖3。

由圖3可知,當α-%%時,固定化酶的活性先增高而后趨于穩定,但固定效率卻逐步降低。

這主要是由于固定化酶凝膠小球內固定的酶量先漸漸增加而后趨于飽和,過多結合的酶造成酶分子聚集成團,酶分子活性中心可能被部分遮蓋,與底物不能充分接觸,從而影響固定化酶活性與固定效率。

圖3不同濃度酶對固定化酶活性及固定效率的影響不同濃度***化鈣對固定化酶活性的影響分別取濃度為1%、2%、4%、8%的***化鈣溶液進行試驗,結果見圖4。

由圖4可知,固定化酶活性在***化鈣濃度變化范圍內先增加而后漸漸降低。

當***化鈣濃度為2%時,固定化酶相對活性最高,固定效果最佳。

圖4不同濃度***化鈣對固定化酶活性的影響4種不同濃度***化鈣制備的固定化酶平均直徑分別為、、、圖5,即當***化鈣濃度漸漸增加時,固定化酶的直徑隨之減小。

推想可能是海藻酸鈉中的α-1,4-古羅糖醛酸結構與鈣離子交聯形成蛋盒-結構,***化鈣主要影響的是交聯程度,其濃度越高,固定化酶結構的致密程度越高,因此濃度大的***化鈣會降低固定化酶的活性與直徑。

圖5不同濃度***不同濃度對固定化酶活性的影響分別取濃度為0、%、%、%、%的溶液進行試驗,結果見圖6。

由圖6可知,%時,固定效果最佳。

固定化酶活性隨濃度的增加漸漸上升,%時,混合液的黏度增加,固定化酶活性降低。

固定化α-淀粉酶的正交試驗圖6不同濃度對固定化酶活性的影響正交試驗結果見表2。

由表2可知,最佳固定化酶的制備工藝為1221,其中各因素影響大小依次為、、、。

利用最佳組合淀粉酶%,***化鈣2%,羧***纖維素鈉%,海藻酸鈉%進行驗證試驗,%。

可見,優化后的工藝固定效率較高,穩定可行。

表2正交試驗結果試驗號1234567891111222333123123123123231312123312231固定效率%23固定化酶與游離酶的酶學性質比較對固定化酶與游離酶活性的影響在最佳工藝條件下,取、、、、、、,測定游離酶與固定化酶的活性,試驗結果見圖7。

由圖7可知,,與游離酶相對活性相比,固定化酶的相對酶活變化幅度不大,即固定化酶在變化范圍內能夠保持相對較高的酶活,相比游離酶具有更寬的適應性。

圖7對固定化酶與游離酶活性的影響溫度對固定化酶與游離酶活性的影響在最佳工藝條件下,于45~80℃測定游離酶與固定化酶活性,試驗結果見圖8。

由圖8可知,游離酶被固定化以后,其最適反應溫度由原來的60℃上升至65℃,當反應溫度連續提高時,固定化酶活性明顯高于游離酶,這可能是由于固定化載體提高了酶空間結構對熱的穩定性。

圖8溫度對固定化酶與游離酶活性的影響固定化酶與游離酶熱穩定性的比較將游離酶與固定化酶分別在60、75、90℃后再測定酶活,以放置在4℃冰箱內的游離酶與固定化酶作為對比,試驗結果見圖9。

由圖9可知,在高溫條件下,固定化酶活性損失明顯小于游離酶,即使在90℃,其仍能保持33%左右的相對酶活,而游離酶的相對酶活只剩不到10%。

圖9固定化酶與游離酶熱穩定性的比較不同濃度聚乙二醇對固定化酶活性的影響分別加入濃度為%、%、%、%、%、%、%的聚乙二醇4000制備多孔固定化酶,以不加聚乙二醇的樣品作為對比,試驗結果見圖10。

由圖10可知,添加聚乙二醇4000后,固定化酶活性均高于對比,%時,固定化酶活性最高,,明顯有利于酶促反應的進行。

游離酶與固定化酶米氏常數的比較利用-作圖法以1對1[]作圖,根據直線在橫軸上的截距-1求米氏常數,結果見圖11。

結果表明,,添加聚乙二醇固定化酶的為,而游離酶的為,即不加聚乙二醇的固定化酶對底物的親和力最小,這與固定化載體的空間障礙與集中限制有關;添加聚乙二醇后,固定化酶形成的多孔結構有利于提高對底物的親和力,且這2種固定化酶對底物的親和力均小于游離酶。

圖10不同濃度聚乙二醇對固定化酶活性的影響圖11游離酶與固定化酶米氏常數的比較3小結本試驗采納海藻酸鈉包埋交聯法制備固定化α-淀粉酶,探討了最佳