選修3當代生物科技專項專項1基因工程第1頁DNA重組技術基本工具

基礎梳理1.基因工程概念基因工程是指按照人們愿望，進行嚴格設計，通過__________和__________，賦予生物以__________遺傳特性，發明出符合人們需要新生物類型和生物產品。基因工程是在__________上進行設計和施工，又叫做__________。DNA重組技術體外DNA重組轉基因技術新DNA分子水平第2頁2.基因工程基本工具(1)“分子手術刀”——__________①起源：主要是從__________中分離純化出來。②功能：能夠識別雙鏈DNA分子某種__________核苷酸序列，并且使每一條鏈中__________部位兩個核苷酸之間__________斷開，因此具有__________性。③成果：經限制酶切割產生DNA片段末端一般有兩種形式：__________和__________。專一限制性核酸內切酶（限制酶）原核生物特定特定磷酸二酯鍵黏性末端平末端第3頁(2)“分子縫合針”——__________①兩種DNA連接酶（E?coliDNA連接酶和T4-DNA連接酶）比較：a.相同點：都縫合__________鍵。b.區分：E?coliDNA連接酶起源于__________，只能將雙鏈DNA片段互補__________之間磷酸二酯鍵連接起來；而T4DNA連接酶能縫合__________，但連接平末端之間磷酸二酯鍵效率較__________。②與DNA聚合酶作用異同:DNA聚合酶只能將__________加到已有核苷酸片段末端，形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶是連接__________末端，形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶大腸桿菌磷酸二酯黏性末端兩種末端低單個核苷酸兩個DNA片段第4頁(3)“分子運輸車”——__________①運載體具有條件a.能在受體細胞中復制并穩定保存。b.具有一至多種限制酶切點，供外源DNA片段插入。c.具有標識基因，供重組DNA判定和選擇。②最常用運載體是__________,它是一種裸露、構造簡單、獨立于__________核區DNA之外，并具有__________雙鏈__________DNA分子。③其他運載體：__________、__________。動植物病毒載體質粒細菌自我復制能力環狀噬菌體第5頁

一、基因工程概念基因工程別名基因拼接技術或DNA重組技術操作環境生物體外操作對象基因操作水平DNA分子水平基本過程剪切→拼接→導入→體現成果人類需要基因產物歸納整合第6頁二、DNA連接酶與DNA聚合酶DNA連接酶與DNA聚合酶都能形成磷酸二酯鍵，但二者性質各不相同。（1）DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有核酸片段3′末端羥基上，形成磷酸二酯鍵；而DNA連接酶是在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，不是在單個核苷酸與DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。（2）DNA聚合酶是以一條DNA鏈為模板，將單個核苷酸通過磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補DNA鏈；而DNA連接酶是將DNA雙鏈上兩個缺口同步連接起來。因此DNA連接酶不需要模板。第7頁（3）另外還介紹幾個酶①解旋酶：該酶能在DNA復制或轉錄時破壞DNA堿基對間氫鍵，從而將雙螺旋打開。②DNA水解酶：該酶能催化DNA水解。③RNA聚合酶：該酶能在轉錄時將單個核糖核苷酸連接成RNA單鏈。④限制酶：該酶作用是識別特定核苷酸序列，并在特定位點上切割DNA分子。第8頁三、基因工程操作工具1.“分子手術刀”——限制性核酸內切酶2.“分子縫合針”——DNA連接酶第9頁3.“分子運輸車”——基因進入受體細胞運載體(1)使用運載體目標在基因工程中使用運載體有兩個目標：一是用它作為運載工具，將目標基因轉移到宿主細胞中去；二是利用它在宿主細胞內對目標基因進行大量復制。(2)運載體種類目前所利用運載體主要有兩類：一類是細菌質粒，它是一種相對分子質量較小、獨立于細菌核區DNA之外雙鏈環狀DNA。另一類運載體是噬菌體或某些滅活病毒等。目前人們還在尋找新運載體，如葉綠體或線粒體等也也許成為運載體。第10頁

(3)作為運載體必須具有條件：①能復制能在宿主細胞內穩定地保存并大量復制，方便提供大量目標基因②具有多種限制酶切點具有多種限制酶切點，方便與外源基因連接。每種酶切點最佳只有一種，如大腸桿菌pBR322就有多種限制酶單一識別位點，可適用于多種限制酶切割DNA插入③具有某些標識基因具有某些標識基因，方便進行篩選。如大腸桿菌pBR322質粒攜帶四環素抗性基因，就能夠作為篩選標識基因④對宿主細胞無害載體必須是安全，對宿主細胞無害⑤載體DNA大小應合適載體DNA分子大小應合適，方便提取和在體外進行操作，太小就不能操作第11頁3.“分子運輸車”——基因進入受體細胞運載體一般來說，天然運載體往往不能滿足上述要求，因此必須根據不一樣目標和需要，對運載體進行人工改造。目前使用質粒運載體幾乎都是通過改造。第12頁1．(2023·全國Ⅱ，5)下列論述符合基因工程概念是A．B淋巴細胞與腫瘤細胞融合，雜交瘤細胞中具有B淋巴細胞中抗體基因B．將人干擾素基因重組到質粒后導入大腸桿菌，取得能產生人干擾素菌株C．用紫外線照射青霉菌，使其DNA發生變化，通過篩選取得青霉素高產菌株D．自然界中天然存在噬菌體自行感染細菌后其DNA整合到細菌DNA上答案：B第13頁2．(2023·浙江理綜，2)在用基因工程技術構建抗除草劑轉基因煙草過程中，下列操作錯誤是()A．用限制性核酸內切酶切割煙草花葉病毒核酸B．用DNA連接酶連接經切割抗除草劑基因和載體C．將重組DNA分子導入煙草原生質體D．用含除草劑培養基篩選轉基因煙草細胞答案：A第14頁基因工程基本操作程序

基礎梳理基因工程基本操作程序包括：目標基因獲取、基因體現運載體構建、將目標基因導入受體細胞及目標基因體現與檢測等四個步驟。1.目標基因獲取(1)目標基因：__________。(2)原核基因采取__________取得，真核基因通過__________取得。人工合成目標基因常用辦法有__________和__________。編碼蛋白質構造基因直接分離人工合成反轉錄法化學合成法第15頁(3)PCR技術擴增目標基因①原理：__________。②過程第一步：加熱至90～95℃__________；第二步：冷卻到55～60℃，引物結合到互補DNA鏈；第三步：加熱至70～75℃，熱穩定DNA聚合酶從引物起始互補鏈合成。2.基因體現運載體構建(1)目標：使目標基因在受體細胞中__________，并且能夠__________，使目標基因能夠__________。(2)組成：__________＋__________＋__________＋__________DNA解鏈DNA雙鏈復制標識基因穩定存在遺傳至下一代體現和發揮作用目基因啟動子終止子第16頁1.目標基因獲取常用辦法：①從基因文庫獲取目標基因基因組文庫（一種生物所有基因）部分基因文庫：如cDNA文庫（部分基因）②利用PCR技術擴增目標基因原理：生物體外DNA雙鏈復制原理③通過DNA合成儀直接人工合成基因較小，核苷酸序列已知，能夠人工合成。

考點歸納第17頁啟動子終止子目基因標識基因表達載體模式圖2.基因體現載體構建目：是使目基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代(關鍵）第18頁①啟動子：是一段有特殊構造__________，位于基因__________，是__________識別和結合部位，能驅動基因轉錄出__________，最后取得所需__________。②終止子：也是一段有特殊構造__________，位于基因__________。③標識基因作用：是為了判定受體細胞中是否具有目標基因，從而將具有目標基因細胞篩選出來。常用標識基因是__________。DNA片段首端RNA聚合酶mRNA蛋白質DNA片段尾端抗生素基因第19頁3.將目標基因導入受體細胞(1)轉化：目標基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和體現過程。(2)常用轉化辦法將目標基因導入植物細胞：采取最多辦法是__________，其次尚有__________和__________等。將目標基因導入動物細胞：最常用辦法是__________。此辦法受體細胞多是__________。將目標基因導入微生物細胞：原核生物作為受體細胞原因是__________________________，最常用原核細胞是____________________________。其轉化辦法是：先用__________處理細胞，使其成為__________，再將重組體現運載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態細胞混合，在一定溫度下促進感受態細胞吸取DNA分子，完成轉化過程。農桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法顯微注射技術受精卵繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對較少大腸桿菌Ca2+感受態細胞(3)重組細胞導入受體細胞后，篩選具有基因體現運載體受體細胞根據是__________是否體現。標識基因第20頁3.將目標基因導入受體細胞中辦法比較生物種類植物細胞動物細胞微生物細胞常用措施受體細胞轉化過程農桿菌轉化法,基因槍法，花粉管通道法顯微注射法Ca2＋處理法體細胞受精卵原核細胞目標基因插入Ti質粒T-DNA上→農桿菌→導入植物細胞→整合到受體細胞染色體DNA→體現目標基因體現載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發育→取得具有新性狀動物Ca2＋處理細胞→感受態細胞→重組體現載體與感受態細胞混合→感受態細胞吸取DNA分子第21頁4.目標基因檢測與判定(1)首先要檢測轉基因生物染色體DNA上是否插入了目標基因，辦法是采取_____________________________。(2)其次還要檢測目標基因是否轉錄出了mRNA，辦法是采取_____________________________________。(3)最后檢測目標基因是否翻譯成蛋白質，辦法是從轉基因生物中提取蛋白質，用對應抗體進行_________。(4)有時還需進行______________判定。如轉基因抗蟲植物是否出現抗蟲性狀。個體生物學水平DNA分子雜交技術用標識目標基因作探針與mRNA雜交抗原－抗體雜交第22頁4.目標基因檢測內容和辦法比較類型步驟檢測內容措施成果顯示分子水平檢測第一步

第二步第三步個體水平判定目標基因是否插入受體細胞染色體DNA上DNA分子雜交技術(DNA和DNA之間)是否成功顯示出雜交帶目基因是否轉錄出mRNA核酸分子雜交技術(DNA和mRNA之間)同上目基因是否翻譯出蛋白質蛋白質分子雜交(抗原—抗體之間)同上包括抗蟲或抗病接種試驗；基因工程產品與天然產品進行活性比較，以確定功能是否相同等第23頁總結：二者組成成份及構造基本相同目基因通過轉錄和翻譯表達遺傳信息生物共用一套遺傳密碼基因重組一、基因工程有關原理第24頁歸納整合

一、外顯子與內含子一般來說，真核細胞基因都是由外顯子和內含子組成。原核細胞基因真核細胞基因不一樣點編碼區連續，無內含子，構造簡單編碼區有間隔，不連續，有內含子；構造復雜相同點都有編碼區和非編碼區；編碼區都有調控遺傳信息體現核苷酸序列；編碼區上游都有與RNA聚合酶結合位點二、原核細胞與真核細胞基因構造比較第25頁基因工程應用及生物技術安全性

基礎梳理1.植物基因工程：抗蟲、抗病、抗逆轉基因植物，利用轉基因改良植物__________。2.動物基因工程：提升動物生長速度、改善畜產品品質、用轉基因動物生產__________。3.基因治療：_______________導入病人體內，使該基因體現產物發揮作用。把正常外源基因品質藥品第26頁二、植物基因工程與動物基因工程成果外源基因類型及舉例成果舉例抗蟲轉基因植物抗蟲基因：Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制劑基因、淀粉酶抑制劑基因抗蟲水稻、抗蟲棉、抗蟲玉米抗病轉基因植物抗病毒基因：病毒外殼蛋白基因、病毒復制酶基因抗真菌基因：幾丁質酶基因抗病毒煙草、抗病毒小麥、抗病毒番茄、抗病毒甜椒抗逆轉基因植物抗逆基因：滲入壓調整基因、抗凍蛋白基因、抗除草劑基因抗鹽堿和抗干旱煙草、抗寒番茄、抗除草劑大豆和玉米第27頁外源基因類型及舉例成果舉例改良品質轉基因植物優良性狀基因：提升必需氨基酸含量蛋白質編碼基因、控制番茄成熟基因、與花青素代謝有關基因高賴氨酸玉米、耐儲存番茄、新花色矮牽牛提升生長速度轉基因動物外源生長激素基因轉基因綿羊、轉基因鯉魚改善畜產品品質轉基因動物腸乳糖酶基因乳汁中含乳糖較少轉基因第28頁外源基因類型及舉例成果舉例生產藥品轉基因動物藥用蛋白基因+乳腺蛋白基因啟動子等調控組件轉基因動物具有乳腺生物反應器作器官轉移植供體轉基因動物將外源抗原決定基因體現調整因子導入到器官供體基因組或除去供體抗原決定基因無免疫排斥反應轉基因豬第29頁1．安全性問題 (1)食物安全面：也許合成出毒蛋白，出現新過敏原，變化食物營養成份。 (2)生物安全面：有也許造成“基因污染”，危害生物多樣性。 (3)環境安全面：有也許打破物種界限，變化生態系統能量流動和物質循環；造成二次污染或產生出危害動、植物和人類生物或產物。轉基因生物安全性問題

第30頁2．轉基因生物存在安全性原因 (1)目前對基因構造、調控機制及基因間互相作用理解有限； (2)目標基因往往是異種生物基因； (3)外源基因插入宿主基因組部位往往是隨機。第31頁3．理性看待轉基因生物 (1)轉基因生物優缺陷分析優點缺點1.處理糧食短缺問題2．減少農藥使用，減少環境污染3．增加食物營養，提升附加值4．增加食物種類，提升食物品質5．提升生產效率，帶動有關產業發展1.也許產生新病毒或新過敏原2．也許產生抗除草劑雜草3．也許使疾病傳輸跨越物種障礙4．也許會損害生物多樣性5．也許干擾生態系統多樣性(2)看待轉基因生物正確態度是趨利避害，不能因噎廢食。第32頁嚴禁生物武器

基礎梳理1.種類：致病菌、病毒、生化毒劑，以及通過__________致病菌。2.散布方式：吸入、誤食、接觸帶菌物品、被帶菌昆蟲叮咬等。3.特點：__________、多數具__________、傳染途徑__________、污染面__________、__________、__________、__________等。4.__________生物武器條約及中國政府態度。(103)嚴禁基因重組致病力強傳染性多廣有潛伏期不易被發覺危害時間長第33頁歸納整合一、基因診斷與基因治療1.基因診斷(1)原理：DNA分子雜交。(2)過程：制備用放射性同位素（如32P）、熒光分子等標識DNA（患者DNA）分子作探針；將待測DNA制成單鏈；讓二者進行雜交，若二者能進行互補配對，則說明患有此病，不然不患此病。2.基因治療---治療遺傳病最有效伎倆。(1)原理：把正常外源基因導入有基因缺陷細胞中，達成治療疾病目標。病人細胞中現有缺陷基因，也有正常基因。第34頁(2)辦法：體外基因治療和體內基因治療。(3)體外基因治療：先從病人體內取得某種有關細胞，進行培養，然后在體外完成基因轉移，再篩選成功轉移細胞擴增培養，最后重新輸入患者體內，這種辦法叫做體外基因治療。例如：復合型免疫缺陷癥。(4)體內基因治療：直接向人體組織細胞中轉移基因治療辦法叫做體內基因治療。舉例：基因治療過程（以鐮刀型細胞貧血癥治療為例）第35頁舉例：基因治療過程（以鐮刀型細胞貧血癥治療為例）步驟過程獲取正常血紅蛋白基因用限制性核酸內切酶從人DNA分子中切取血紅蛋白基因形成重組運載體用同一種限制性核酸內切酶在運載體DNA上切開一種切口，用DNA連接酶將正常血紅蛋白基因連接在運載體DNA上，形成重組運載體重組運載體轉化與篩選將攜帶正常血紅蛋白基因重組運載體導入患者造血干細胞中，并將重組運載體插入到染色體。用選擇培養基篩選出含重組質粒造血干細胞將含正常血紅蛋白基因造血干細胞回輸給患者骨髓將攜帶正常血紅蛋白基因造血干細胞輸入患者骨髓中，此造血干細胞產生含正常血紅蛋白紅細胞，以根治鐮刀型細胞貧血癥成果：健康基因體現掩蓋了缺陷基因體現。第36頁說明：對于遺傳病治療，最主線辦法是進行基因替代或修復。基因治療最佳時期理論上是受精卵時期，這樣能夠使個體每個細胞都具有正常基因，但在現實生活中是不也許，由于不也許人人都在受精卵時期進行基因檢查。其次是對患者進行有關細胞基因替代，如對于遺傳性糖尿病患者，只對胰島B細胞進行基因替代，該個體就能正常分泌胰島素，糖尿病得以治療。但這種局部細胞基因替代，并沒有變化其他部位細胞基因，如精原細胞等，因此，患者后裔很也許還會患遺傳性糖尿病。第37頁基