核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)1核磁共振是解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的一種重要方法優(yōu)點(diǎn)：不需結(jié)晶；可研究動(dòng)力學(xué)。缺點(diǎn)：受分子量限制，需要標(biāo)記。核磁共振是解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的一種重要方法優(yōu)點(diǎn)：不需結(jié)晶；可研究2MalatesynthaseG(82kDa)MalatesynthaseG(82kDa)3RichardRobertErnst

ErnstwasawardedtheNobelPrizeinChemistryin1991forhiscontributionstowardsthedevelopmentofFourierTransformnuclearmagneticresonancespectroscopyandthesubsequentdevelopmentofmulti-dimensionalNMRtechniques.RichardRobertErnstErnstwas4KurtWüthrich

HewasawardedhalfoftheNobelPrizeinChemistryin2002for"hisdevelopmentofnuclearmagneticresonancespectroscopyfordeterminingthethree-dimensionalstructureofbiologicalmacromoleculesinsolution".KurtWüthrichHewasawardedh5核磁共振的原理自旋量子數(shù)（I）

原子序數(shù)和原子質(zhì)量都為偶數(shù)：I=0(12C,16O)原子序數(shù)為奇數(shù)，原子質(zhì)量為偶數(shù)：I=整數(shù)(14N,2H,10B)原子質(zhì)量為奇數(shù)：I=半整數(shù)(1H,13C,15N,31P)核磁共振的原理自旋量子數(shù)（I）6自旋狀態(tài)（M）M=I,(I-1),(I-2),…,-I

對(duì)于1H,13C,15N,31P來說: M=1/2,-1/2自旋狀態(tài)（M）7凡自旋不為零的原子核，在外加靜磁場(chǎng)中發(fā)生能級(jí)裂分，共振吸收一特定頻率的射頻電磁場(chǎng)能量的現(xiàn)象，即為核磁共振。Bo=0Bo>0ΔE=γhBo

/2π=hυabγ為磁旋比，由核的性質(zhì)所決定。凡自旋不為零的原子核，在外加靜磁場(chǎng)中發(fā)生能級(jí)裂分，共振吸收一8核磁共振的靈敏度

Nα-Nβ

Nα/Nβ=eΔE/kT

ΔE=γhBo/2π對(duì)于在400MHz(Bo=9.5T)磁場(chǎng)下的1H：Nα/Nβ=1.000064核磁共振的靈敏度9磁場(chǎng)越強(qiáng)，靈敏度越高磁旋比越大，靈敏度越高γ1H=26.75rad/G；γ13C=6.73rad/G；γ15N=-2.71rad/G核的豐度越高，靈敏度越高第五章-核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)ppt課件10第五章-核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)ppt課件111H譜天然豐度高；靈敏度高。13C譜天然豐度低；靈敏度低；化學(xué)位移拓展寬、分辨率好15N譜天然豐度低；靈敏度低；化學(xué)位移拓展寬、分辨率好1H譜12核磁共振的頻率

ΔE=γhBo

/2π

υ=γBo

/2π

ΔE=hυ

在常用磁體（2.35-18.6T）下，1H的共振頻率在100-800MHz范圍，13C為它的1/4，15N為它的1/10。10-10 10-810-610-410-2100102wavelength(cm)

g-rays

x-rays

UVVIS

IR

m-waveradio核磁共振的頻率10-10 10-810-613進(jìn)動(dòng)(larmor)頻率

ω=2πν

ω0=γB0進(jìn)動(dòng)(larmor)頻率14第五章-核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)ppt課件15第五章-核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)ppt課件16第五章-核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)ppt課件17核磁共振的主要參數(shù)化學(xué)位移耦合常數(shù)峰強(qiáng)核歐佛豪斯效應(yīng)（NOE）橫向馳豫時(shí)間縱向馳豫時(shí)間線寬核磁共振的主要參數(shù)化學(xué)位移18化學(xué)位移不同的原子處于不同的化學(xué)環(huán)境，即處于不同的電磁環(huán)境,因此表現(xiàn)出不同的共振頻率：

υ=γ（Bo±B）/2πω=2πυ=γ(Bo±B)化學(xué)位移不同的原子處于不同的化學(xué)環(huán)境，即處于不同的19逆磁屏蔽逆磁屏蔽20微磁環(huán)境微磁環(huán)境21Beff=B0-Bloc---Beff=B0(1-σ)Beff=B0-Bloc---Beff=B0(1-σ)22化學(xué)位移的表示方法H3CSiCH3CH3CH3化學(xué)位移的表示方法H3CSiCH3CH3CH323AromaticImines AmidesHCb,g,d,...HCawater109876543210AromaticImines AmidesHCb,g,d24影響化學(xué)位移的效應(yīng)：環(huán)流位移效應(yīng)環(huán)狀分子的大π電子云產(chǎn)生的附加磁場(chǎng)對(duì)核的影響順磁離子效應(yīng)金屬離子對(duì)周圍核的影響pH滴定效應(yīng)不同pH下各基團(tuán)解離情況的不同對(duì)化學(xué)位移的影響影響化學(xué)位移的效應(yīng)：25耦合常數(shù)自旋耦合

共價(jià)鍵（1-4個(gè)鍵）相連核之間的特性張量的相互作用13C1H1H1Hone-bondthree-bond耦合常數(shù)自旋耦合13C1H1H1Hone-bondthree26自旋裂分

由于被測(cè)核與相鄰核自旋耦合引起的譜線裂分，裂分的大小稱為耦合常數(shù)aaabbabbI

SSSIIJ(Hz)自旋裂分aaabbabbI SSSIIJ(Hz)27第五章-核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)ppt課件28耦合常數(shù)不隨磁場(chǎng)的變化而變化兩核耦合引起對(duì)方譜線裂分的大小相等相距越遠(yuǎn)、所隔鍵數(shù)越多，耦合越弱重原子比輕原子耦合強(qiáng)耦合常數(shù)的大小與耦合核的二面角有關(guān)第五章-核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)ppt課件29第五章-核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)ppt課件30峰強(qiáng)、馳豫和線寬峰強(qiáng)與共振粒子數(shù)成正比。縱向馳豫是高能原子核將其多余能量交給周圍介質(zhì)而返回低能態(tài)的過程。橫向馳豫是由于磁場(chǎng)不均等因素引起的磁化矢量的相移。由于磁場(chǎng)的不均一，會(huì)導(dǎo)致譜線增寬。線寬為橫向馳豫時(shí)間的倒數(shù)。分子翻滾速率、溶液粘度和分子內(nèi)部運(yùn)動(dòng)性等影響線寬。峰強(qiáng)、馳豫和線寬峰強(qiáng)與共振粒子數(shù)成正比。31縱向馳豫（T1）縱向馳豫（T1）32橫向馳豫（T2）橫向馳豫（T2）33NOE不同核之間通過空間的偶極相互作用，其強(qiáng)度與核間距的六次方成反比。若用射頻照射核A，其譜峰被抑制，與其空間靠近的另一核B的譜峰會(huì)略有增強(qiáng)，其增強(qiáng)的程度，即為NOE強(qiáng)弱的度量。因NOE的強(qiáng)度與核間距有關(guān)，所以是分子結(jié)構(gòu)中的最重要參數(shù)。NOE不同核之間通過空間的偶極相互作用，其強(qiáng)度與核間距的六次34一維譜共振峰強(qiáng)度隨頻率（化學(xué)位移）變化一維譜共振峰強(qiáng)度隨頻率（化學(xué)位移）變化35第五章-核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)ppt課件36二維譜吸收峰強(qiáng)度對(duì)兩個(gè)頻率變量作圖二維譜吸收峰強(qiáng)度對(duì)兩個(gè)頻率變量作圖37COSYCOSY38TOCSYTOCSY39NOESYNOESY401H共振的分布1H共振的分布41異核二維譜異核二維譜42多維譜多維譜43多維NMR解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)多維NMR解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)44譜峰認(rèn)證譜峰認(rèn)證45自旋體系認(rèn)證自旋體系認(rèn)證46第五章-核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)ppt課件47序列認(rèn)證序列認(rèn)證48第五章-核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)ppt課件49第五章-核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)ppt課件50NOE認(rèn)證TOCSY NOESYLeuAlaAsnGlyNHHCLeuAlaAsnGlyNHHCNOE認(rèn)證TOCSY NOESYLeuAla51用于NMR結(jié)構(gòu)計(jì)算的約束NOE—5?化學(xué)位移—二級(jí)結(jié)構(gòu)偶極常數(shù)—二面角氫氘交換—?dú)滏I順磁馳豫增強(qiáng)(PRE)—遠(yuǎn)距離（30?）殘余偶極耦合(RDC)—空間定向用于NMR結(jié)構(gòu)計(jì)算的約束52特征NOE與二級(jí)結(jié)構(gòu)特征NOE與二級(jí)結(jié)構(gòu)53化學(xué)位移與二級(jí)結(jié)構(gòu)化學(xué)位移與二級(jí)結(jié)構(gòu)54偶極耦合與二面角偶極耦合與二面角55氫氘交換與結(jié)構(gòu)和氫鍵氫氘交換與結(jié)構(gòu)和氫鍵564.04.0(Has)4.08.0 (NHs) 7.0t=0-NoD2OAddD2Ot=t1t=t24.04.04.08.0 (NHs) 7.0t=57第五章-核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)ppt課件58由核磁數(shù)據(jù)構(gòu)建蛋白質(zhì)溶液三維結(jié)構(gòu)由核磁數(shù)據(jù)構(gòu)建蛋白質(zhì)溶液三維結(jié)構(gòu)59StrongNOE 1.8-2.7?MediumNOE 1.8-3.3?WeakNOE 1.8-5.0?3JNa<5Hz-80<f<403JNa>8Hz-160<f<-80StrongNOE 1.8-2.7?3JNa<560第五章-核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)ppt課件61核磁共振譜儀的組成MagnetProbeConsoleComputer核磁共振譜儀的組成Magnet62對(duì)磁體的要求高磁場(chǎng)強(qiáng)度高穩(wěn)定性高均勻性對(duì)磁體的要求63高磁場(chǎng)強(qiáng)度：高分辨率高靈敏度高磁場(chǎng)強(qiáng)度：高分辨率高靈敏度64信噪比的完全方程信噪比的完全方程65第五章-核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)ppt課件66第五章-核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)ppt課件67第五章-核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)ppt課件68樣品的準(zhǔn)備溶劑的選擇

1.樣品在其中有高溶解度；

2.在我們所感興趣的波譜范圍內(nèi)沒有溶劑峰；

3.在做變溫實(shí)驗(yàn)的溫度范圍內(nèi)保持液體狀態(tài)。

通常使用一些氘代溶劑

減少溶劑峰的干擾采用氘核內(nèi)鎖穩(wěn)定磁場(chǎng)，起鎖場(chǎng)的作用H2O

是生物分子最適宜的溶劑(90%H2O,10%D2O)樣品的準(zhǔn)備溶劑的選擇69蛋白質(zhì)NMR研究的溶液條件pH不要大于7。緩沖體系要保證蛋白質(zhì)的穩(wěn)定及高溶解度。蛋白質(zhì)的濃度通常要求有數(shù)mM。避免緩沖液中其他成份對(duì)蛋白質(zhì)譜圖的干擾。無機(jī)