實驗二、紙層析法分析氨基酸一、實驗目的1.掌握紙上層析的一般原理和操作方法。2.了解氨基酸的特征性顏色反應。3.學會分析未知樣品的氨基酸成分。實驗二、紙層析法分析氨基酸一、實驗目的1紙上層析法是分配層析法中的一種，常以濾紙為惰性支持物。紙上層析法是分離、鑒定和定量測定氨基酸、糖類、抗生素等有機物質的一項重要而簡便的分析方法。所用設備簡單、操作方便，使用樣品少，分離效果好，為近代生物化學分析中重要技術之一。此法廣泛地應用于科研和生產分析工作中。

二、實驗原理紙上層析法是分配層析法中的一種，常以2常以水和有機溶劑作為展層劑；水和有機溶劑互溶后形成兩個相：一個是飽和了有機溶劑后的水相,一個是飽和了水后的有機溶劑相。由于濾紙纖維素上的羥基和水分子有較大的親和力,其吸附的水相為固定相,有機溶劑相為移動相。由于物質的極性大小不同,在兩相中分配比例有所差異。極性小的物質在有機相中分配較多,隨有機相移動較快；而極性大的物質在水相中分配較多,移動相對較慢,從而將極性不同的物質分開紙上層析的原理常以水和有機溶劑作為展層劑；水和有機溶劑互溶后形3在相同的條件下，每種物質都有其固定的Rf值。Rf值的定義為：原點到層析斑點中心的距離Rf=原點到溶劑前沿的距離在相同的條件下，每種物質都有其固定的Rf值。4影響Rf值的因素有：

①物質本身的化學結構；②展層所用溶劑系統；③展層劑pH值；④展層時的溫度；⑤展層所用濾紙；⑥展層的方向(橫向，上行或下行)。用紙層析鑒定樣品時，一般都與標準品相比較。若沒有標準品，可選擇文獻記載的該物質層析條件，根據文獻Rf值進行鑒定。影響Rf值的因素有：5三、實驗操作

1、紙的處理取18cm長、18cm寬的濾紙一張，離底邊2cm處用鉛筆輕輕劃一條與底邊平行的線，并等距離的在線上定點樣點(原點)劃圈，使圈的直徑小于0.4cm。2、點樣用毛細管點樣，中間點混合氨基酸，兩側點三種標準氨基酸；每個點樣點重復點2-3次，每點一次用電吹風吹干后再點下次（此時，用冷風吹干，防止氨基酸變性降解），點樣點的直徑應控制在2-4mm左右，點樣完畢用大頭針線將濾紙做成筒形，點樣面向里。

三、實驗操作6圖1.點樣2cm圖1.點樣2cm7展層劑展層劑圖2.濾紙的縫合展層劑展層劑圖2.濾紙的縫合83、平衡點樣以后將濾紙與層析缸用配好的溶劑系統蒸汽來飽和，這個過程稱為平衡(30min),否則，濾紙會從溶劑中吸收水分，溶劑也會從濾紙表面揮發，使溶劑系統的組分發生改變，嚴重時紙上會出現不同水平的溶劑前沿，影響層析效果。4、展層向層析缸中加入層析溶劑（高約1.5cm），液層不要超過點樣線，將濾紙點樣點朝下放入層析溶劑中，將層析缸密閉，待溶劑到達濾紙上邊線1-2cm時取出冷風吹干。

3、平衡點樣以后將濾紙與層析缸用配好的溶劑系統蒸95、顯色用噴霧器向濾紙上均勻噴灑0.1%茚三酮，熱風吹干(加快反應)反應顯色(或晾干后，將濾紙放入烘箱中80-100℃，烘烤5分鐘后)，濾紙上即顯出紫紅色或黃色的氨基酸斑點。四、結果處理

1、用鉛筆將層析色譜輪廓和中心點描出來。2、測量原點至色譜中心和至溶劑前沿的距離，計算各種已知氨基酸和未知氨基酸色譜的Rf值。3、分析混合樣品中未知氨基酸的組分。5、顯色用噴霧器向濾紙上均勻噴灑0.1%10圖3.層析譜

1．原點；2．層析點；3．溶劑前沿圖3.層析譜

1．原點；2．層析點；3．溶劑前沿11五、注意事項(1)在整個操作過程中，手只能接觸濾紙邊緣，否則手指上的氨基酸會造成濾紙上眾多斑點。(2)在點樣時，不要將毛細管插錯了試劑瓶。(3)點樣斑點不能太大（其直徑應小于0.5cm），防止