免疫酶技術及其應用

——ELISA.1免疫酶技術及其應用

——ELISA.1酶聯免疫法

ELISA

50年代的免疫熒光（IFA）和60年代的放射性免疫（RIA）分析技術之后，70年代初又建立了用酶來標記抗原或抗體的分析技術

1971年瑞典學者Engvail和Perlmann,荷蘭學者VanWeerman和Schuurs分別報道將免疫技術發展為檢測體液中微量物質的固相免疫測定方法，即酶聯免疫吸附測定法(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)。它是一種特殊的試劑分析方法，是在免疫酶技術(immunoenzymatictechniques)的基礎上發展起來的一種免疫測定技術。.2酶聯免疫法

ELISA50年代的免疫熒光（IFA）和免疫標記技術免疫標記技術（immunolabellingtechnique）:

是指用熒光素、放射性同位素、酶、發光劑或電子致密物質等作為示蹤劑，標記抗體或抗原進行的抗原抗體反應。特點：高度靈敏、特異、快速，定性、定量、定位分類：免疫酶技術、免疫熒光技術、放射免疫技術、免疫電鏡技術、免疫膠體金技術和發光免疫測定.3免疫標記技術免疫標記技術（immunolabellingt免疫酶技術免疫酶技術(enzymeimmunoassay)：是將抗原和抗體的特異性免疫反應與酶的催化反應相結合而建立的一種免疫檢測技術。

就是利用酶標記抗體或抗原，以檢測相應抗原或抗體的一種免疫學標記技術。常用的酶：辣根過氧化物酶(HRP)

堿性磷酸酶（AP）。.4免疫酶技術免疫酶技術(enzymeimmunoassay)基本原理①使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據顏色反應的深淺來進行定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。

.5基本原理①使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活酶聯免疫法

ELISA.6酶聯免疫法

ELISA.6.7.7實驗材料ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的材料：1.固相的抗原或抗體2.酶標記的抗原或抗體3.酶作用的底物。根據試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具備條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。4.相應的檢測儀器..8實驗材料ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測檢測方法1。夾心法雙抗體夾心法測抗原（常用）雙抗原夾心法測抗體2。間接法測抗體（常用）3。競爭法競爭法測抗原競爭法測抗體4。捕獲包被法測抗體5。親和素-生物素ELISA法.9檢測方法1。夾心法.9雙抗體夾心測抗原.10雙抗體夾心測抗原.10雙抗體夾心測抗原待測抗原須有兩個可以與抗體結合的部位，其一端與包被于固相載體上的抗體結合，另一端與酶標記的特異性抗體結合。此法適用于檢驗各種二價或二價以上的大分子抗原，如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。不能用于分子量小于5000的半抗原或小分子單價抗原的測定。.11雙抗體夾心測抗原待測抗原須有兩個可以與抗體結合的部位，其一端雙抗原夾心法測抗體反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相應的抗體。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用于測定。乙肝標志物中HBsAb的檢測常采用本法。關鍵在于根據抗原結構的不同制備酶標抗原。.12雙抗原夾心法測抗體反應模式與雙抗體夾心法類似。.12間接法測定抗體.13間接法測定抗體.13間接法的特點本法主要用于對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗體檢測相應抗體。間接法成功的關鍵在于抗原的純度。特別應注意除去能與一般健康人血清發生反應的雜質。若抗原中含有無關蛋白，也會因竟爭吸附而影響包被效果。.14間接法的特點本法主要用于對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷競爭法測抗原.15競爭法測抗原.15競爭法測抗原（1）將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。

（2）待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應，孵育洗滌。（3）加底物顯色：參考管中由于結合的酶標抗原最多，故顏色最深。待測管顏色越淡，表示標本中抗原含量越多。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標本抗原的量。.16競爭法測抗原（1）將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗競爭法測抗原◆如受檢標本中無抗原，則酶標抗原能順利地與固相抗體結合。◆如受檢標本中含有抗原，則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結合，競爭性地占去了酶標抗原與固相載體結合的機會，使酶標抗原與固相載體的結合量減少。◆參考管中只加酶標抗原，孵育后，酶標抗原與固相抗體的結合最充分。.17競爭法測抗原◆如受檢標本中無抗原，則酶標抗原能順利地與固相抗競爭法測抗體當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。標本中抗體量越多，結合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應呈色淺于陰性反應。.18競爭法測抗體當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的捕獲包被法測抗體樣品中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，后者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗本多用捕獲法。先將所有樣品IgM（包括特異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再測定特異性IgM。.19捕獲包被法測抗體樣品中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性I操作步驟如下（1）將抗IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗IgM，洗滌。（2）加入稀釋的待測標本：孵育后樣品中的IgM抗體被固相抗體捕獲，洗滌。（3）加入特異性抗原試劑：其僅與固相上的特異性IgM結合，洗滌。（4）加入針對抗原的酶標抗體：使之與結合在固相上的抗原反應結合，洗滌。（5）加底物顯色：如有顏色顯示，則表示標本中存在特異性IgM抗體，是為陽性反應。.20操作步驟如下（1）將抗IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗親和素-生物素-ELISA法親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。每個分子由4個亞基組成，可以和4個生物素分子親密結合。生物素（biotin）又稱維生素H，存在于蛋黃中。可與蛋白質、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產物。親和素與生物素的結合，雖不屬免疫反應，但特異性強，親和力大，形成一種極為穩定的復合體。把親和素和生物素與ELISA偶聯起來，就可大大提高ELISA的敏感度。.21親和素-生物素-ELISA法親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提3.與固相抗原的競爭結合

取稀釋板中預孵育的抗原抗體混合液100μl，加入酶標板的抗原孔中，放入37℃恒溫培養箱中60min。洗板3次。100ul稀釋板酶標板37℃，60min洗板3次適用于優點注意雙抗體夾心法測抗原是檢測抗原最常用的方法，適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原特異性高不能檢測小分子抗原及半抗原雙抗原夾心法測抗體乙肝標志物中抗HBs的檢測常采用本法受檢標本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法關鍵在于酶標抗原的制備，應根據抗原結構的不同，尋找合適的標記方法。間接法測抗體是檢測抗體最常用的方法,本法主要用于對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體

1.關鍵抗原的純度2.另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性抗體

競爭法測抗原小分子抗原如激素和藥物等ELISA測定多用此法。快，只有一次保溫洗滌過程需要較多的酶標記抗原.223.與固相抗原的競爭結合100ul稀釋板酶標板37℃，60實驗材料：羊抗人血清白蛋白抗體（一抗）已知含量的人血清白蛋白（作標準曲線）待檢人血清白蛋白辣根過氧化物酶標記的驢抗羊抗體（二抗）包被液CBS：PH9.6，0.05mol/L碳酸鹽緩沖液洗板液或稀釋液：PH7.4，0.01mol/LPBS底物溶液：OPD-H2O2終止液：2mol/LH2S04酶標反應板（一條/人）方法適用于競爭法測抗體當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢驗特異性抗體捕獲包被法測抗體主要用于血清中某種抗體亞型成分（如IgM）的測定ABS-ELISA

法ABS-ELISA較普通ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，在臨床檢驗中ABS-ELISA應用不多。

.23實驗材料：方法適用于競爭法測抗體當抗原材料中的干擾物質不易除.24.24實驗前準備：制備純化抗原或抗體制備抗原或抗體包備液包被微孔板制備酶標記抗體或抗原制備酶催化底物終止液.25實驗前準備：制備純化抗原或抗體.25實驗步驟：1.加樣：加待檢樣品0.05ml于已包被之反應孔中，置37℃孵育30分鐘。(設置空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔各加0.05ml對照標準)。2.洗滌,新鮮配置洗滌液注滿微孔,停滯15秒棄去.重復5次.3.加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體(經滴定后的稀釋度)0.05ml。37℃孵育30分鐘.4.洗滌,新鮮配置洗滌液注滿微孔,停滯15秒棄去.重復5次.

5.加底物液顯色：于各反應孔中加入底物A液和底物B液各0.05ml，置37℃孵育15分鐘。6.終止反應：于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。7.結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺。也可測O·D值：在ELISA檢測儀上，以空白對照孔調零后測各孔O·D值，若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。.26實驗步驟：1.加樣：加待檢樣品0.05ml于已包被之反應孔中實驗操作：.27實驗操作：.27固定OD值.28固定OD值.28.29.29三、操作步驟包被抗原

抗原用包被液（CBS）稀釋至合適濃度，加入到酶標板中，100μl/孔，放入濕盒中，4℃過夜。次日，用洗板液洗板3次（將洗板液加入每孔，1min后傾去），以洗去未包被的游離抗原。抗原100ul/孔濕盒中，4℃過夜酶標板.30三、操作步驟包被抗原次日，用洗板液洗板3次（將洗板液加入每孔抗原與抗體的預孵育制作標準曲線：