1第十二單元DNA的復制和修復DNDN的復制由親代傳給子代。在子代的生長發育中遺傳信息自DNRNA然后翻譯成蛋白質以執行各種生命功能，使后代表現出與親代1958F.Crick提出中心法則：〔1〕DN分子為模板，合成出一樣DN分子的過程?！?DNN〔3〕mRN為模板，依據三聯密碼規章，合成對應蛋白質的過程。中心法則提示了生物體內遺傳信息的傳遞方向。DN生物合成有兩種方式：DN復制和反轉錄。DN〔真核細胞器DNA〔線粒體、葉綠體〕病毒〔雙鏈，環狀〕。DNA的體外復制：分子克隆。一、DNA的復制〔一〕DNA半保存復制1953年Watso和Crick在提出DN雙螺旋構造模型時就推想DN可能依據半保存機制進展DNDNDN分子中有一條鏈DNA另一條是合成的。1958年MeselsoStahl1NE.coli.DNADN的復制是半保存復制。1963年Cairn.coli.染色體DNA。E.coli.DNA，經過將近兩代時間，用溶菌酶消化細胞壁，將E.coli.DNA轉至膜上，枯燥，壓感光膠,3H 放出B 粒子，復原銀，在光學顯微鏡下觀看。用這種方法證明白大腸桿菌染色體DNA是一個環狀分子,并以半保存的形式進展復制0DNA的半保存復制可DNA在代謝上的穩定性。經過多代復制，DNA的多核苷酸鏈仍可以保持完整，并存在于后代而不被分解掉?！捕硰椭破瘘c、單位和方向DNA的復制是在起始階段進展把握的，一旦復制起始，它就會連續下去直到整個復制子完成復制。復制起點復制起點是以一條鏈為模板起始DN合成的一段序列。有時，兩條鏈的復制起點并不總是在同一點上〔D環復制〕。DN呼吸作用猛烈〔甲醛變性試驗〕的區段，即常常開放的區段，富含.T。復制起點的克隆和功能分析一一重組質粒轉化法大腸桿菌的復制起點oriC區1Kb勺重組質2oriC245bp勺根本功能區，攜帶它的質粒照舊能夠自我復2045bp勺根本功能區，而打算拷貝數1Kb之間。96bpDN86%同源性，而且有些親緣關系較遠的細菌，其復制起點在大腸桿菌中亦能起作用。因此，復制起始區的構造可能是很保守的。起始序列含有一系列對稱的反向重復和某些短的成簇的保守序列。復制單位〔Replicon〕GenomIDN；都在一個固定的起點開頭復制，復制方向大多數是雙向的，少數是單向復制。多數是對稱復制，少數是不對稱復制(一條鏈復制后才進展另一條鏈的復制。DNB,B形復制。DN是線形雙鏈分子，含有很多復制起點，因此是多復制子，每個復制子約有100-200Kbp人體細胞平均每個染色體含有00(個復制子。DNA多種多樣，環狀或線形，雙鏈或單鏈，但都是單復制子。復制方向復制，形成一個復制叉。DN的復制方向及速度，用低放射性H-脫氧胸苷短期標記，再用高放射性常-脫氧胸苷標記，假設為單向，一側高，另一側低。假設為雙向，中間低，兩側高。E.coli42CDNA在完成復制后，不再開頭的復制過程，25C時復制功又能能恢復。DNA的幾種復制方式：直線雙向復制：單點，雙向，T7;多點，雙向，真核染色他NABDNA，單向或雙向(E.coli)滾環復制：環狀單鏈DNA0x174DDNA多復制叉復制第一輪復制尚未完成復制起點就開頭其次輪的復制在.coli.富養分時，可實行多復制叉復制方式OE.coli.DNA的復制最快可達50Kb/min完全復制需40min富養分時，20mir分裂。而真核染色體要6 8小時。DN復制有關的酶及蛋白質因子30DNM制3(一)DN的聚合反響和聚合酶DN5,-3，3,-5，DN聚合反響必備的條件⑵DNA板(RN模板)⑶引物(DNA、RN或蛋白質)⑷4dNTP⑸Mg+2聚合反響過程及特點3-x磷原子發生親核攻3,.5，-磷酸二酯鍵，并脫下焦磷酸。DN聚合酶的反響特點：4dNT為底物NT的聚合。3-羥基存在5，-3，DN的性質與模板一樣DNDN聚合類型發莢環構造：參與單鏈)N作為模板和引物，3羥基端回折成引物鏈。末端延長聚合：參與雙鏈)N作為模板和引物，3”末端突出作為模板。分枝型和切口平移型聚合：參與雙鏈)NA聚合發生在切口或末端單鏈區。DN作為模板。E.coliDNA聚合酶45E coli.DNApol.(Kornberg酶,400copy/cgll單體酶，Mr109KdZrT40(DN/pol.I，催化活性：5，—3，聚合活性；3，5，外切活性；5，3，外切活性。DNApol.I局部水解可得：大片段〔KlenoW75Kd活性：5，-3，聚合活性、3，-5，外切活性。36Kd活性：5，-3，外切活性〔只作用于雙鏈〕N的堿基配對局部，切除修復〕KlenowDNA3DNcDN其次鏈；dDN測序。E.coli.DNAPol.11〔100copy/cell〕120Kd催化活性：5，-3，聚合〔活性很低〕；3,-5，外切活性，可能在DNA的修復中起某中作用。E.coli.DNApcffi〔復制酶，10-20copy/c0ll1C22個亞基組成，a、&B三種亞基組成核心酶。DNApol.E是合DNReplicase〕，5，-3,DNADN6個結合位點DN結合位點⑵引物結合位點3-0竝點、反響位點dNT結合位點， ⑸5 3 外切位點〔pol.U沒有， ， ⑹3 -5 外切位點〔校正， DN聚合酶DNDN復制中起校正功能。⑴DNa,DN⑵DNBDN損傷的修復中起作用。⑶DN聚合酶丫，從線粒體得到，可能與線粒體DN復制有關。，⑷DN聚合酶S,可合成DN鏈，有3-5 外切活力〔有校對活性〕，功能與E.coli.DNApol.M相像，是負責DN復制的主要的酶。，〔二〕RN聚合酶〔引發酶〕I細胞內，DN〔DNRNA,弓物酶或RN6-10RNI引物。DNRNAIDN聚合酶要用引物，RN聚合酶不需要引物？⑴從模板復制最初幾個核酸時，堿基堆集力和氫鍵都較弱，易發生錯配；, ,DN5-3校對功能難發揮, 〔三〕I、U、川與“epDN兩條鏈解開。解螺旋酶、IIIII5”-3rep3”-5”方向移動?！菜摹矰N旋轉酶DNU,可引入負超螺旋，消退復制叉前進時帶來的扭曲張力。拓撲異構酶分兩類：III，廣泛存在于原核生物和真核生物。IDN區，與轉錄有關。拓撲異構酶n使DNT布在染色質骨架蛋白和核基質部，與復制有關?！参濉矰N結合蛋白〔SSB復制叉上的解螺旋酶，沿雙鏈〕N前進，產生單鏈區，大量的單鏈〕N結合蛋白與單鏈區結DN不被核酸酶降解?！擦矰N連接酶〔ligase〕DN上的切口。大腸桿菌連接酶只能在模板上連接〕N缺口。TQNAligase即可連接粘性末端的DNADNAE.coli.和其它細菌的DNAligase以NADNAligaseAT為能源。三、CNAS制的拓撲構造DNA復制時，超螺旋構造和雙螺旋構造的解開由DNA拓撲異構酶、解螺旋酶、單鏈DNA結合蛋白協同作用完成。四、DNA勺半不連續復制DN的半不連續復制DN5,-3稱滯后鏈，先延著與復制叉前進方向相反的方向，有-3,方向合成短片段即岡崎片段，隨后又Kb-2Kb相當于一個順反子的大小。真核為10200bpDN的長度。DN復制過程〔E.coli.〕復制的起始DNN引物的過程。、引發體：引物合成酶與各種蛋白質因子〔dnaBdnaGn nzn“I〕構成的復合體，負責RN、引物的合成。5”—3〔方向一樣〕，移到確定位置上即可引發引物的合成。710大腸桿菌復制原點起始復制所需蛋白質:DNaA在原點處翻開雙螺旋DNaBDN解旋DNaCDNaB結合在原點所需Hu刺激起始引物酶〔DNaGRN引物SSB結合單鏈DNARN聚合酶大腸桿菌復制原點起始復制所需蛋白質:DNaA在原點處翻開雙螺旋DNaBDN解旋DNaCDNaB結合在原點所需Hu刺激起始引物酶〔DNaGRN引物SSB結合單鏈DNARN聚合酶DNa活性旋轉酶DN扭曲應力20Dna9bp重復區，形成起始復合物，DN13bpt復區依次變性，產生開放型復合物。DnaB〔Dna幫助下〕與開放復合物結合，進一步解鏈。DN鏈的延長反響RNRN引物，鏈的延長DNApol.m催化。DN合成的生長點〔既復制叉上〕分布著很多與復制有關的酶和關心因子，它DN的模板鏈形成離散的復合物，彼此協作進展高度準確的復制，稱為復制體。復制體沿DNARNA^|物的切除及缺口補齊DNApoll5，—3，RN引物。DNApol5，—3，合成活性補齊缺口。DNAU口的連接DNAligase,ATNA哄能。DNA合成的終止DNADNA復制叉相遇即終止。小結：⑴DNADNA⑵SSBDN單鏈。⑶DNA旋轉酶引入負超螺旋，消退復制叉前進時帶來的扭曲張力。⑷DNA引物酶〔在引發體中〕RN引物。⑸DNApol.DNA〔6〕DNApollRNDNAmDNAligase連接一個岡崎片段。DNdTTdUT的區分力氣高，dUT摻入DN鏈中，此時，U-糖苷酶、A吶切酶、DNApoll、DNAligase共同作用，切除尿嘧啶，接上正確的堿基。DN的復制復制起點和單位真核生物染色體DN是多復制子，有多個復制起點，可以多點起始，分段進展復制。每個復制子大多在100 200bp之間，比細菌染色體DNA〔單復制子〕小得多。試驗證據：5-氟脫氧胞苷標記試驗。DN3Kb5Kb早期胚胎細胞中相鄰復制起點的平均距離為.9kb,40kb，成體細胞只利用一局部復制起點。復制過程中組蛋白的裝配在真核生物的復制子上，親代染色體的核小體被逐個翻開，組蛋白以完整的八聚體形式直DNN的復制是半保存的，而組蛋白則是全保存的。試驗證據：環己酮亞胺抑制組蛋白合成，電子顯微鏡下觀看。DN復制的終止DN序列與蛋白質形成的一種復合體，是真核細胞染色體末端所特有的構造。其功能為：DN的完整復制⑵保護染色體末端⑶打算細胞壽命，胚系細胞含端粒酶，體細胞不表達端粒酶。端粒(telomeres1OObp5，(TxGyn3(AxCy)n,xy—般為1?4。，端粒末端的重復序列，通過端粒酶(telomerase)將其加到染色體末端。端粒酶含有RNA和DN聚合酶的作用)兩種組分，RN159bCyA重復序列，RN端粒TxGN模板互補的DN片段。50-200bp，1?4KbP寸，細胞就停頓分裂。假設能重建端粒，則細胞可以永久分裂。惡性腫瘤細胞端酶表達增多。DNAT制的調控DNA復制的調控與其生長環境有關，但其調控的機制有待深入爭論。真核生物DNA復制的調控與細胞周期蛋白等多種蛋白質因子有關其機制格外簡潔，目前已取得不少研10究成果，但尚有很多問題需進一步爭論解決。DN復制的真實性DN07?10堿基對,只有一個錯誤堿基。堿基對的自由能通常在4?13KJ/mo,這樣的自由能相當于平均參入10(個核苷酸就可能消滅Watson-Crick02。DN/聚合酶對堿基的選擇作用NT合。DNNT摻入引物末端。酶樂觀參與理論:DN聚合酶對正確與錯誤的核苷酸，不僅親和性不同，而且將它們插入DNA引物端的速度也不同。NT結合在酶與模板一引物復合物的聚合位點上，DNJNTPDNDNDN模板一引物,另一種是dNTPDN聚合酶先識別DN3,dNTP是一種有序的識別過程。3，5,外切活性的校正閱讀E.coli.DNApol.Ipol.m3-5,外切活性，可刪除錯誤插入的核苷酸。， 缺失3，-5,外切活性的E.coli.DN/pol.I，催化DN合成時，消滅錯誤的幾率增巌-50倍。因此，3 -5外切活性可以使DN復制的真實性，提高?2， DNA合成真實性的因素,⑴高濃度3-/皿卩,5-GMP)NMdNT結合位點，抑制?—5外切活性。,dNT濃度銀高,3,末端離開外切活性中心。?dNTP-般與二價陽離子結合成活化形式,Mg+11M?代替Mg+時，會轉變酶的主體構造，影響聚合活性和，—3外切活性。RN引物⑴從模板復制最初幾個核酸時，堿基堆集力和氫鍵都較弱，易發生錯配。⑵復制的最初幾個核苷酸，沒有與模板形成穩定雙鏈,DN5,—3,校對功能難發揮作用。七、DNA勺損傷及修復4DN然而在確定條件下，生物機體能使這種損傷得到修復。紫外線可使DN分子中同一條鏈上兩個相鄰的胸腺嘧啶堿基之間形成二聚體TT，兩個T以共價鍵形成環丁烷構造。CTCC間也可形成少量二聚體(CTCC,使復制、轉錄受阻。細胞內具有一系列起修復作用的酶系統可以除TDN 上的損傷恢復DN的雙螺旋構造。目前有4種酶修復系統：光復活、切除修復、重組修復S0反響誘導的修復，后三種不需要光，又稱為暗修復。直接修復194400nm形成的嘧啶二聚體。高等哺乳動物沒有此酶。切除修復在一系列酶的作用下，將DN分子中受損傷局部切除，并以完整的那一條鏈為模板,合成出切去局部，DN恢復正常構造。構造缺陷的修復：DN損傷部位，在其四周將其切開。核酸外切酶切除損傷的DNADN聚合酶修復。1213DN連接酶連接。4.----------------------N-糖苷酶〕：甲基磺酸甲酯可使鳥嘌呤第位氮原子烷基化，活化B-糖苷鍵，造成脫嘌呤作用；酸也能使DN脫嘌呤。DN復制時，DNdTTdUT區分力不高，有少量dUTDN鏈。細胞中的尿嘧啶-N-糖苷酶可以切掉尿嘧啶。腺嘌呤脫氨形成次黃嘌呤時也可以被次黃嘌啾-糖苷酶切掉次AP核酸內切酶切開，核酸外切酶切除,DN聚合酶修復，DN連接酶連接。插入酶插入正確堿基重組修復DNDN發動復制時尚未修復的損傷部位，可以先復制，在重組修復過程中，DN鏈的損傷并未除去。4recA40000勺蛋白質，它具DN重組和重組修復中均起關鍵作用°recB、recC基VN聚合酶和連接酶。易錯修復和應急反響〔SO反響〕DNDN復制系統受到抑制的緊急狀況下，為求得生存而SO反響誘導的修復系統包括避開過失的修復〔無過失修復〕和傾向過失的修復。避開過失的修復:SO反響能誘導光復活切除修復和重組修復中某些關鍵酶和蛋白質的產生，從而加強光復活切除修復和重組修復的力氣，這屬于避開過失的修復。傾向過失的修復:SO反響還能誘導產生缺乏校對功能的〕NDN損傷部位進行復制而避開了死亡，可是卻帶來了高的突變率，這屬于傾向過失的修復。SORecLexASRecA白不僅在同源重組中起重要作用，而且它也是SO反響的最初發動因子。在有單鏈DNAT存在時，Rec蛋白被激活而表現LexAt白。LexAS白〔22Kd很多基因Rec的蛋白水解酶分解后就可以使一系列基因得到表達其中包括紫外線損傷的修復基因uvrA、uvrBuvrC〔分別編碼核酸內切酶的亞基〕ecAlexA基因本身，ssb,DNhimA與誘變作用有關的基因jmuD,CsulA,ruvon，以及一些功能不清楚的基因iinA,B,D,F等。SO反響廣泛存在于原核生物和真核生物它是生物在極為不利的環境中求得生存的一種基本功能。SO50反響的作用劑通常都具有致癌作O反響，5-溴尿嘧啶。目前，有關致癌物的一些簡便檢測方法就是根擴O反響原理而設計的，既測定SO反響。八、RNADN合成〔反轉錄〕反轉錄〔reversetranscription〕RN為模板，合成DNA與通常轉錄過程中遺傳信息流DNRN的方向相反。197〔年，TeminBaltimoreRN病毒〔勞氏肉瘤病毒和鼠白血病病毒〕中覺察RN病毒是一大類能引起鳥類、哺乳類等動物白血病、肉瘤以及其它腫瘤的病毒。這類病毒侵染細胞后并不引起細胞死亡，卻可以使細胞發生惡性轉化。經過改造后可以作為基因治療的載體。D〔DN為模板的反響，復制和轉錄〕RN病毒的復制，可見致癌RNDNABader用嘌呤霉素(puromycin肉瘤病毒(RSV,證明反轉錄酶是由反轉錄病毒帶入細胞的，而不是感染后在宿主細胞中合成的。aB亞基組成，含有ZrT,具有三種酶活力。RNDNRN為模板，合成一條互補的DNARN—DN雜種”RNaseRN—DNRNA3—55—3兩個方向起外”切酶作用。DNDN聚合酶活力。模板：RNDNARN為模板時，該酶的反轉錄活力最大，但是帶有適當引物的任何種類的RNDN的模板。I物：RNDNA底物：dNTP二價陽離子：MgMn+mRNApolyAoligodTDNARN的反轉錄過程RN病毒都含有反轉錄酶，因此被稱為反轉錄病毒retrovirus)，反轉錄病4DN中間體(前病毒)。1反轉錄病毒的基因組構造反轉錄病毒基因組通常由兩條一樣的+)RN鏈組成。5”端四周區域以氫鍵結合在7~10KbRN鏈的兩端具有一樣的序列，形成正向重復序列。5”端有帽子構造，3”polyAmRNA似。51tRNAtRNAPtRNA°反轉錄過程。RNRNDNA其過程為：以病毒〔+〕RN為模板，合成互補的〔〕DNARN—DNRNA以〔-〕DN鏈為模板，合成〔+〕DNM，最終形成兩端帶有LTR〔長末端重復序列〕DNAN后才能被轉錄，轉錄產物經拼接可以產生不mRNA_TR〔長末端重復序列〕DNDN以及整合后的轉錄均起著重要作用。反轉錄病毒合成的過程缺口的模板〔基因組〕RNAUDNRN的引物，而其余的模板RNADN合成開頭，復制。反轉錄病毒的生活周期病毒粒子侵染細胞，病毒和反轉錄酶一起進入細胞。RNDN〔前病毒〕，環化，進入細胞核。DNDN中。DNN和病毒蛋白。RN和病毒蛋白在胞質中組裝成病毒粒子，轉移到質膜，通過出芽方式反轉錄的生物學意義。RNRN病毒引起細胞惡性轉化有關。艾滋病毒(AIDS即人類免疫缺陷病毒(HIV,也是一種反轉錄病毒主要感「 淋巴細4BlOOnm球狀，粒子外包被兩層脂質質膜，膜上有糖蛋白(gp12Qgp41)324p1&HIVN組成，每個鏈長9.7kb,RNA5端有帽子構造，3PolyA,鏈上結合有反轉錄酶。DN等成分，與反轉錄病毒有明顯的區分。真核生物正常細胞內也存在反轉錄過程真核生物的