發(fā)根農(nóng)桿菌誘導桑樹毛狀根體系的建立孔衛(wèi)青;楊金宏;盧從德【摘要】應用發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060,以直接接種和共培養(yǎng)2種方法侵染桑樹10d齡子葉，并將2種處理的外植體分別接種于MS+AS（乙酰丁香酮,100pmol/L）的平板,暗培養(yǎng)2d后轉接至MS+CS（頭孢霉素,200mg/L）平板培養(yǎng)3周，每3d轉接1次以除去其中所含的發(fā)根農(nóng)桿菌菌體，結果2種侵染方法均成功誘導桑樹產(chǎn)生毛狀根，誘導效率分別為14%和17%.在無激素MS培養(yǎng)基上離體培養(yǎng)除菌后的毛狀根，呈現(xiàn)旺盛的生長態(tài)勢和典型的發(fā)狀根結構特點.CTAB法提取毛狀根基因組并進行PCR檢測，結果擴增出了423bp的rolB基因片段，表明Ri質(zhì)粒的T-DNA已經(jīng)成功整合到桑樹的基因組中.【期刊名稱】《西北植物學報》【年（卷），期】2010（030）011【總頁數(shù)】4頁（P2317-2320）【關鍵詞】桑樹;發(fā)根農(nóng)桿菌;毛狀根;誘導【作者】孑L衛(wèi)青;楊金宏;盧從德【作者單位】安康學院，陜西省蠶桑重點實驗室，陜西安康,725000;安康學院，陜西省蠶桑重點實驗室，陜西安康,725000;安康學院，陜西省蠶桑重點實驗室，陜西安康,725000【正文語種】中文【中圖分類】Q789Abstract:Usingdirectinfectionandco2culturingwithbacteriamethod,102daysmulberrycotyledonwerewound2inoculatedwithAgrobacteriumrhizogenesstrainsACCC10060inordertoobtainhairyroots.Ex2plantswereculturedindark2daysontheMS+AS(Acetosyringone,100pmol/L),thentransferredontoMS+CS(Cefotaximsodium,200mg/L)inordertocurethebacteria,andreplacedevery3daysfor3weeks.Bothinfectionmethodsweresuccessfullyobtainedmulberryhairyroots,andtherateofinductionare14%and17%,respectively.TherootgrewvigorouslyonMSmediumwithoutanyhormoneandhashairyrootcharacters.GenomicDNAofthehairyrootswasextractedbyCTABmethodanda423bpfrag2mentwasamplifiedwithprimersofrolB,indicatedthatT2DNAofRihadintegratedintomulberrygenome.Keywords:mulberry;Agrobacteriumrhizogenes;hairyroots;induction根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)和發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)均是革蘭氏陰性土壤細菌，分別應用其Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒侵染植物傷口進入細胞,并將其上含有的一段T2DNA插入到植物基因組中［1］。但因為野生型根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T2DNA上具有致病基因，該基因的表達和植株再生不相容，所以通常將目的基因插入到經(jīng)過維呷”改造的T2DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實現(xiàn)外源基因向植物細胞的轉移與整合，然后通過細胞和組織培養(yǎng)技術，再生出轉基因植株［2］。而野生型發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的TL2DNA上有rolA2D基因群,TR2DNA有tms基因,能誘發(fā)被感染植物的受傷部位產(chǎn)生大量的毛狀根［3］,且Ri質(zhì)粒T2DNA上的基因不影響植株的再生，轉化效率高啟前已在甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)、煙草(Nicotianataba2cumL.)、藍豬耳(ToreniafournieriL.)、鈍莨菪(Hy2oscyamusmuticusL.)等中獲得成功［427］。同時，發(fā)根農(nóng)桿菌也可以轉化雙元Ti質(zhì)粒，將Ti質(zhì)粒上的一段DNA整合進植物基因組,穩(wěn)定地遺傳給后代，且發(fā)根農(nóng)桿菌能夠感染大多數(shù)雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物及裸子植物，所以利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導植物細胞產(chǎn)生毛狀根是20世紀80年代發(fā)展起來并得到廣泛應用的植物基因工程技術，在植物代謝物的生產(chǎn)上顯示了巨大的應用潛力［8,9］。桑樹(MorusalbaL.)是蠶桑生產(chǎn)的主要物質(zhì)基礎，同時桑樹中也含有大量的次生代謝物,具有重要的經(jīng)濟和研究價值。在桑樹的基因工程研究上啟MachiiH采用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtu2mefaciens)葉盤轉化系統(tǒng)成功地將外源基因導入桑葉盤，并獲得轉化株以來，根癌農(nóng)桿菌在桑樹的基因工程上得到了廣泛的應用［10］。Sandhya等［11］利用根癌農(nóng)桿菌和桑細胞共培養(yǎng)的方法也獲得了轉化植株。陸小平等［12］用根癌農(nóng)桿菌整株轉化方法對真葉開放期的桑苗進行試驗，也成功獲得了桑樹的轉基因植株。但目前還沒有利用發(fā)根農(nóng)桿菌進行桑樹毛狀根誘導及轉基因研究的報道，本實驗利用發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060侵染桑樹10d齡子葉，成功建立了一種簡單、易于操作的發(fā)根農(nóng)桿菌介導的桑樹毛狀根的誘導體系，為桑樹的轉基因和桑樹毛狀根次生代謝物的研究利用奠定了基礎。1.1植物夕卜植體的準備選取當年收獲的桑樹’沙2’品種的種子，蒸餾水沖洗1h,75%乙醇浸泡15min,30%H2O2浸泡5min,無菌水沖洗4~6次后，無菌濾紙吸干表面水分。用酒精燈灼燒消毒后的鑷子將消毒后的種子接種于MS固體平板上,置于25°C,12h光照條件下培養(yǎng)，約1周后種子萌發(fā)，長出子葉。暗培養(yǎng)2~3d,待用。1.2供試菌株的活化供試菌株為野生型發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060,購自中國農(nóng)業(yè)微生物保藏中心。劃線發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060于YEB平板,25C避光培養(yǎng)2d長出菌落，連續(xù)劃線活化培養(yǎng)2次后，應用2種方法對供試菌株進行再次活化。方法一:繼續(xù)劃線平板培養(yǎng)一次。方法二挑單菌落于YEB液體培養(yǎng)基中,25^,180r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6~0.8,離心收集菌體，用MS培養(yǎng)基重懸至OD600為1.0。1.3桑樹毛狀根的誘導用直接接種法和共培養(yǎng)法誘導桑樹產(chǎn)生毛狀根。（1） 直接接種法用刀片切下1.1中萌發(fā)種子長出的子葉,接種針輕微創(chuàng)傷子葉正面,再于1.2方法一活化的發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060菌斑上輕輕蘸下。（2） 共培養(yǎng)法將創(chuàng)傷后的桑樹子葉置于1.2方法二活化并重懸于MS培養(yǎng)基的發(fā)根農(nóng)桿菌AC2CC10060菌液中10min。將2種處理的外植體分別接種于MS+AS（乙酰丁香酮,100Mmol/L）的平板，暗培養(yǎng)2d后，轉接至MS+CS（頭孢霉素,200mg/L）平板上繼續(xù)培養(yǎng)，每3d轉接1次以除去其中所含的發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060的菌體。1.4毛狀根的離體培養(yǎng)與PCR檢測剪取經(jīng)3周除菌培養(yǎng)后的毛狀根根尖2~3cm,置于MS培養(yǎng)基進行離體培養(yǎng)。根據(jù)發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060的Ri質(zhì)粒的TL2DNA上的rolB基因的序列設計引物,然后PCR擴增rolB基因,以檢測其是否成功轉入桑樹，引物序列為rolBF:5'2GCTCTTGCAGTGCTAGATTT23，;rolBRS2GA2AGGTGCAAGCTACCTCTC23',引物由上海生工生物工程有限公司合成。取除菌完全的毛狀根基部適量,CTAB法提取基因組DNA,同時用正常桑樹葉片的基因組DNA做對照,進行PCR擴增。擴增反應采用25"體系,程序為94°C預變性4min;95°C30s;57C30s;72C40s,30個循環(huán);最后72C再延伸6min。擴增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色，紫外燈下檢測。2.1不同方法誘導桑樹產(chǎn)生毛狀根的效率應用直接接種法和共培養(yǎng)法進行發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060侵染桑樹子葉，外植體經(jīng)MS+AS（乙酰丁香酮,100pmol/L）平板、MS+CS（頭孢霉素,200mg/L）平板培養(yǎng),2種侵染方法均成功誘導桑樹產(chǎn)生毛狀根,其中共培養(yǎng)法的誘導桑樹產(chǎn)生毛狀根的效率為17%,直接接種法為14%（表1）,共培養(yǎng)方法的誘導效率高于直接接種法。但由于直接接種法操作方便，而且該方法誘導產(chǎn)生的桑樹毛狀根的生長速度快于共培養(yǎng)法因此，本研究后續(xù)實驗采用直接接種法誘導獲得的桑樹毛狀根進行。2.2桑樹毛狀根的離體培養(yǎng)創(chuàng)傷的桑樹子葉經(jīng)直接接種法處理1周后，傷口部位長出白色突起,2周后分化為白色細根，且根的密度較大，生長速度快，生長的根向地性（圖1,A）。3周后毛狀根的顏色開始變黃,子葉逐漸枯萎（圖1,B）。此時分別剪取2-3cm根尖置于MS培養(yǎng)基進行離體培養(yǎng)，離體的毛狀根能在MS培養(yǎng)基上自主生長，且生長速度快,形成大量分支,2個月后鮮重約為原來的20倍（圖1,C）。2.3桑樹毛狀根的PCR檢測取18個毛狀根組織提取基因組,進行rolB基因的PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析擴增到一條423bp的條帶，與預期大小一致，而同時以正常桑葉片的基因組DNA為模板沒能擴增到該條帶（圖2）,說明Ri質(zhì)粒的T2DNA已經(jīng)成功整合到桑樹的基因組中,所獲得的毛狀根為發(fā)根農(nóng)桿菌誘導產(chǎn)生的遺傳轉化體。共培養(yǎng)方法是誘導毛狀根的一種經(jīng)典方法具有廣泛的應用。但該方法操作相對復雜,對實驗者的操作技能有一定的要求，同時需要使用一些大型的設備。本研究同時使用了共培養(yǎng)和直接接種法，雖然共培養(yǎng)的誘導效率略高于直接接種法,但差異不大,而相對于共培養(yǎng)方法,直接操作法操作簡便，不需要低溫離心機等大型的貴重儀器，適合大多數(shù)的科研院所使用。發(fā)根農(nóng)桿菌誘導植物產(chǎn)生毛狀根的影響因素很多，如菌液濃度、共培養(yǎng)時間、AS濃度等［13,14］。其中菌液濃度是轉化過程中常常被調(diào)整的因素，菌液濃度過高,發(fā)根農(nóng)桿菌生長過快，不易被抗生素殺死.易導致外植體受到傷害、發(fā)生褐化甚至死亡；菌液濃度過低，又無法感染外植體。本實驗采用的創(chuàng)傷子葉直接接種發(fā)根農(nóng)桿菌的方法基本忽略了上述因素,操作簡單且容易重復。這也可能與實驗采用子葉為夕卜植體有關子葉特別肥厚，貯藏著大量的營養(yǎng)物質(zhì)，誘導的過程中可提高生根率,且不會因為菌液濃度過大而導致死亡。毛狀根可在離體培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出次生代謝產(chǎn)物的合成能力，還能夠合成許多懸浮細胞培養(yǎng)所不能合成的物質(zhì)，某些產(chǎn)物的產(chǎn)量甚至高于正常植物及懸浮細胞培養(yǎng)[15]。因此，毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)在生物量的增加、藥用有效成分的積累以及生產(chǎn)穩(wěn)定性方面，都顯示了其獨特的優(yōu)越性。到目前為止，國內(nèi)夕卜現(xiàn)已成功地培養(yǎng)出黃芪、紫草、紅花、青蒿、決明等藥用植物的毛狀根，人參皂或、黃連素等已通過毛狀根培養(yǎng)得以工業(yè)化生產(chǎn)[16]。桑樹的根中含有大量的次生代謝物質(zhì)，具有重要的研究價值，而桑樹毛狀根的研究在國內(nèi)外尚屬空白，本實驗描述了一種簡便易行的桑樹毛狀根誘導方法，成功獲得了桑樹的毛狀根，為桑樹毛狀根次生代謝物的利用和桑樹轉基因研究奠定了基礎。【相關文獻】GELVINSB.Findingawaytothenucleus[J].Cur.OpinioninMicrobiol,2010,13:53-58.HOEKEMAA,HIRSCHPR.AbinaryplantvectorstrategybasedonseparationofvirandTregionoftheAgrobacteriumtumefaciensTi2plasmid[J].Nature,1983,303:179-180.SCHMBLLINGT,SCHELLJ,SPENAA.PromotersoftherolA,BandCgenesofAgrobacteriumrhizogenesaredifferentiallyregulatedintransgenicplants[J].PlantCell,1989,1:665-670.LUHY,LIUJM,ZHANGHC,TAOY,GAOSL.Ri2mediatedtransformationofGlycyrrhizauralensiswithasqualenesynthasegene（GuSQS1）forproductionofglycyrrhizin[J].PlantMol.Biol.Rep.,2008,26:1-11.CUIH（崔紅）,MUPL（慕平利）,LIXJ（李雪君）,LIUML（劉夢林）WANGZH（王^.Expressionoffarnesyldiphosphatesyn2thasegene（fps）inNicotinantabacumhairyrootviaRi2mediatedtransformation[J].JournalofZhejiangUniversity（Agriculture&LifeScience）（浙江大學學報?農(nóng)業(yè)與生命科學版）,2007,33（4）:355-359（inChinese）.TAOJ,LIL.GenetictransformationofToreniafournieriL.mediatedbyAgrobacteriumrhizogenes[J].SAfr.J.Bot.,2006,72:211-216.JOUHIKAINENK,JOKELAINENT,HILTUNENR,TEERITH,OKSMAN2CALDENTEYKM,LINDGRENL.EnhancementofscopolamineproductioninHyoscyamusmuticusL.hairyrootculturesbygeneticengineering[J].Planta,1999,208（4）:545-551.FUCX,ZHAODX,XUEXF,JINZP,MAFS.TransformationofSaussureainvolucratabyAgrobacteriumrhizogenes:Hairyrootin2ductionandsyringinproduction[J].ProcessBiochem.,2005,40:3789-3794.JINUH,CHUNJA,HANMO,LEEJW,YIYB,LEESW,CHUNGCH.Sesamehairyrootculturesforextra2cellularproductionofarecombinantfungalphytase[J].ProcessBiochem.,2005,40:3754-3762.MACHIIH.Leafdisktransformationofmulberryplant（MorusalbaL.）byagrobacteriumTiplasmid[J].SericultureScienceofJa2pan,1990,59:105-110.SANDHYAA,KAMLESHK,SAININ,JAINRK.AgrobacteriumtumefaciensmediatedgenetictransformationandregenerationofMorusalbaL.[J].ScientiaHorticulturae,2004,100:183-191.LUXP（陸小平）,LOUCHF（樓程富）,SHENFY（沈飛英）,MINEOK（小島拳雄）.MolecularidentificationandphenotypeanalysisoftransgenicmulberryplantbyAgrobacteriumtumefaciensT2DNAintroduction[J].Jour