《細胞工程》實驗教學大綱（供四年制本科生物工程專業使用）Ⅰ前言細胞工程實驗講授以細胞和組織為研究和操作的基本對象、研究細胞工程操作過程中涉及到的細胞培養用液及培養基/液配制，滅菌/濾過除菌，植物組織培養、原代兔腎細胞培養，淋巴細胞分離培養、增殖/轉化試驗：形態法；MTT法、細胞凍存、復蘇等一系列問題。實驗是細胞工程這一學科最重要研究方法，也是這一學科的支撐點。本實驗課程是以細胞工程基本操作為主線，強調實驗方法的經典性、實用性，實驗內容涉及了細胞培養的主要過程，本實驗課中的所有單項實驗都屬于一個整體流程，通過系統的實驗可提高學生的動手操作能力、查閱文獻能力、實驗設計能力、分析解決問題的能力和綜合素質，為學好后續課程，從事專業技術工作和科學研究打下必要的基礎。本大綱適用于四年制本科生物工程專業使用。現將大綱使用中有關問題說明如下:一為了使教師和學生更好地掌握教材，大綱每一章節均由教學目的、教學要求和教學內容三部分組成。教學目的注明教學目標，教學要求分掌握、熟悉和了解三個級別，教學內容與教學要求級別相對應，并統一標示(核心內容即知識點以下劃實線，重點內容以下劃虛線，一般內容不標示)便于學生重點學習。二教師在保證大綱核心內容的前提下，可根據不同教學手段，講授重點內容和介紹一般內容，有的內容可留給學生自學。二學時:總教學參考時數100學時，其中理論課40學時，實驗課60學時。三教材：《細胞培養與細胞工程實驗指導》李官成主編遵義醫學院珠海校區Ⅱ正文實驗一細胞培養實驗室設置、設備和準備工作一教學目的通過本實驗使學生對細胞培養室有基本的認識和了解，使學生掌握無菌操作、孵育、制備、清洗、消毒滅菌和儲藏等組成了細胞操作間。同時準備一些瓶、皿為下次實驗做準備。二教學要求（一）掌握：無菌操作區、凈化工作臺、使用凈化工作臺需注意的方面、倒置顯微鏡、C02培養箱、干燥箱、水純化裝置、冰箱、液氮罐、離心機、天平、消毒滅菌設備、培養用器皿。（二）熟悉：消毒滅菌設備、配液用具。（三）了解：細胞培養常用設備和器材匯總。三教學內容（一）介紹細胞培養實驗室的設置（無菌操作區、凈化工作臺、孵育區、制備區、儲藏區、清洗和消毒滅菌區）。（二）細胞培養實驗室設備（倒置顯微鏡、C02培養箱、干燥箱、水純化裝置、冰箱、液氮罐、離心機、天平）（三）培養用器皿（培養瓶、培養皿、多孔培養板、貯液瓶、吸管、加樣器(移液器)、其他用品、器械）（四）細胞培養常用設備和器材匯總（大型設備工具類、制備、培養、保存細胞用品、配液用具）。實驗二培養用品清洗和消毒滅菌一教學目的組織細胞培養工作需要使用大量的器材,特別是玻璃器皿。培養用品的清洗和消毒滅菌是一項重要而艱苦的任務,通過本實驗的學習使學生掌握相關的用品清洗和消毒滅菌。二教學要求（一）掌握：培養用品清洗的過程和步驟、包裝、干燥、培養用品消毒滅菌、濕熱滅菌、過濾除菌。（二）熟悉：酸液的配制方法、紫外線消毒。（三）了解：干熱滅菌、消毒劑及抗生素、消毒方法選擇。三教學內容（一）培養用品清洗：浸泡、刷洗、清潔液浸泡、沖洗。（二）掌握如下的步驟：1自來水漂洗:用洗衣粉擦洗(用手，不得使用毛刷),自來水漂洗，滴濾過夜。2自來水抽濾3～5遍至無白沫，水滴過夜。3清潔液抽濾1遍,清潔液滴濾過夜。4自來水漂洗抽濾5遍,水滴濾過夜。5蒸餾水抽濾3遍,蒸餾水滴濾過夜。6三蒸水抽濾2遍,三蒸水滴濾過夜,漂洗。7烤干備用。（三）示教包裝（四）培養用品消毒滅菌實驗三細胞培養用液及培養基/液配制一教學目的培養基(液)是維持體外細胞生存和生長的基本溶液,是組織細胞培養最重要的條件?？煞譃樘烊慌囵B基及合成培養基兩大類。實際工作中往往將天然培養基與人工合成培養液結合使用。通過本章的學習使學生掌握細胞培養的有關培養基的配制。二教學要求（一）掌握：血清、RPMI1640培養液、合成培養基(液)的配制過程。（二）熟悉：水解乳蛋白、合成培養基(液)基本成分、Ham培養液。（三）了解：血漿、組織浸出液、199培養液、Eagle培養液。三教學內容（一）天然培養基：血清、血漿、組織浸出液、水解乳蛋白。（二）合成培養基(液)：合成培養基(液)基本成分。（三）常用的合成培養液(基)：199培養液、Eagle培養液、RPMI1640培養液、Ham培養液。（四）合成培養基(液)的配制:用品、步驟、注意事項。（五）無血清培養基(液)：基礎培養液、輔加成分、培養基質、營養成分、酶抑制劑。實驗四植物組織培養及觀察一教學目的植物組織原代培養也叫初代培養,是從供體取得組織細胞后在體外進行的首次培養。原代培養是建立各種細胞系的第一步,是從事細胞培養工作應熟悉和掌握的最基本技術。通過本次實驗使學生掌握原代培養細胞特點及應用。二教學要求（一）掌握：培養室和超凈臺消毒、蘆薈、胡蘿卜的組織快的培養過程與步驟。（二）熟悉取材基本要求、組織塊分離方法。（三）了解取材基本器材和用品、培養前準備。三教學內容（一）蘆薈、胡蘿卜的清洗與消毒：水沖洗2小時、無菌水洗、75%酒精洗、0.1%HgCl洗30秒、在無菌水洗凈（二）取材基本要求：取材的組織最好盡快培養、取材時應嚴格無菌操作、盡可能減少對細胞的機械損傷。（三）取材基本器材和用品：1、眼科剪（直、彎）、鑷子（直、彎）、止血鉗、手術刀；2、裝有無血清培養基或Hank's液的小瓶；3、小燒杯(1Oml，5Oml)；4、培養皿等(特殊用途物品詳見后面章節)。實驗五原代兔腎細胞培養及觀察一教學目的原代培養是獲取細胞的主要手段,但原代培養的組織細胞比較復雜,由多種細胞成分組成,即使生長出同一類型細胞如成纖維樣細胞或上皮樣細胞,細胞間也存在很大差異。如果供體不同,即使組織類型、部位相同,個體差別也可在細胞上反映出來。因而原代培養細胞部分生物學特征尚不穩定,如要做較為嚴格的對比性實驗研究,還需對細胞進行短期傳代后進行。原代培養方法很多,最基本和常用的方法有兩種,即組織塊法和消化法。通過本章的學習學生掌握兔腎細胞培養的基本過程。二教學要求（一）掌握：兔腎細胞培養的用品：Hanks液(也可用無血清培養液)、培養液、培養瓶(必要時瓶內可放置小蓋玻片)、吸管、膠帽、小燒杯(20m1)或青霉素小瓶、眼科剪、5cm培養皿或小玻璃板(8×5cm2)、（二）熟悉：消化培養法、CO2培養相的使用。（三）了解：器官培養、瓊脂基質培養法。三教學內容（一）兔腎細胞培養的步驟：取材、修剪,將組織剪或切成1mm3左右的小塊。在剪切過程中,可適當滴加1～2滴培養液于組織上以保持濕潤、將剪切好的組織小塊,用眼科鑷移入培養瓶內。用牙科針或彎頭吸管將組織塊在瓶壁上均勻擺置,每小塊間距5mm左右。量不宜過多,如50ml的培養瓶(底面積約為17.5cm2),放置20～30組織小塊為宜。也可放于瓶內預置的蓋玻片上。組織塊放置好后，輕輕將培養瓶翻轉讓瓶底朝上,注入適量培養液,蓋好瓶蓋,將培養瓶傾斜放置在37℃溫箱內、放置2～4h待組織小塊貼附后,再將培養瓶慢慢翻轉平放（二）準備兔腎細胞培養的用品。實驗六淋巴細胞分離培養、增殖/轉化試驗（形態法；MTT法）一教學目的通過本實驗的學習是學生了解淋巴細胞分離培養的基本方法與步驟，學習形態法觀察細胞形態、MTT法檢測細胞活力。二教學要求（一）掌握：臺盼藍染色、MTT法、細胞計數、淋巴細胞的分離。（二）熟悉：細胞分裂指數、細胞生長曲線的繪制。（三）了解：伊紅染色試驗。三教學內容（一）淋巴細胞的分離：實驗前腹腔注射1640待實驗時腹腔取淋巴細胞。（二）MTT比色試驗：接種細胞、培養細胞、呈色、比色。（三）形態法：1.制備單個細胞懸液,并作適當稀釋(10?/ml)。2.染色:取9滴細胞懸液移入小試管中,加1滴0.4%臺盼藍溶液,混勻。3.計數:在3min內,用血球計數板分別計數活細胞和死細胞。實驗七懸浮、貼壁細胞株傳代培養、換液及觀察一教學目的培養細胞的生存環境是培養瓶，生存的空間和營養是有限的。當細胞增殖達到一定密度后，則需要分離出一部分細胞和更新培養液，否則將影響細胞的繼續生存，這一過程稱傳代培養（subcultureorpassage）再培養的過程，即將細胞從一個培養瓶分散轉移到另一個培養瓶繼續培養。與細胞倍增（doubling）一代不同，在細胞傳代一代過程中，細胞倍增若干次。通過本實驗的學習使學生掌握HeLa、SP2/0等細胞的培養、換液及觀察。二教學要求（一）掌握：貼壁傳代細胞培養及傳代（HeLa）、懸浮傳代細胞培養及傳代（SP2/0）。（二）熟悉：無菌操作。（三）了解：HeLa、SP2/0細胞生長的特性與環境。三教學內容（一）貼壁傳代細胞培養及傳代（HeLa）。（二）懸浮傳代細胞培養及傳代（SP2/0）。實驗八細胞的凍存與復蘇一教學目的通過本章的學習使學生掌握常用的細胞的凍存與復蘇的操作步驟，熟悉細胞凍存液配制，液氮罐的使用。二教學要求（一）掌握：細胞凍存的方法和原則、細胞復蘇的方法和原則。（二）熟悉：細胞凍存液配制。（三）了解：液氮罐的使用。三教學內容（一）細胞凍存的方法和原則。（二）細胞復蘇的方法和原則。（三）細胞凍存液配制。實驗九骨髓干細胞培養、換液及觀察細胞融合，選擇培養及觀察一教學目的掌握骨髓細胞制備及融合技術。二教學要求（一）掌握：骨髓瘤細胞的制備、飼養層細胞的制備、雜交瘤技術主要用品。（二）熟悉：免疫動物及細胞融合、克隆化培養、骨髓瘤細胞的培養。（三）了解：篩選雜交瘤細胞。三教學內容（一）骨髓瘤細胞的制備。（二）飼養層細胞的制備。（三）細胞融合技術。實驗十基因轉染、克隆化培養（示教）一教學目的通過本實驗的示教，是學生了解基因轉染的方法與克隆化培養的技術，為以后的學習和科研工作打下堅實的基礎。二教學要求（一）掌握：制備單克隆抗體、磷酸鈣共沉淀法。（二）熟悉：克隆化培養的原理、脂質體轉染法、逆轉錄病毒DNA轉染法。（三）了解：雜交瘤細胞染色體鑒定、單克隆抗體鑒定。三教學內容（一）制備單克隆抗體。（二）單克隆抗體鑒定:抗體的特異性、抗體的類別及亞類抗體的中和活性、抗體的親和力、抗體對應抗原的分子量、抗體識別的抗原表位。（三）磷酸鈣共沉淀法：原理、操作、注意事項。（四）脂質體轉染法:原理、操作、注意事項。Ⅲ教學組織與方法一實施機構：由珠海校區生物工程教研室執行。二組織內容：教案講義審核、集體教學備課、教學方法研究、教學手段應用，實驗預作。三教學方法：1采用啟發式、討論式課堂教學方式，輔助現代教育技術和傳統教學手段。核心內容以講授為主，重點內容以介紹為主，一般內容以自學為主。2輔導形式：課堂討論、網絡查詢等相結合。3實驗要求：實驗前加強預習，實驗中及時記錄；實驗后及時完成實驗報告。四考核辦法：實驗成績占期末總評成績的20%。包括三部分：課堂操作占20%，實驗