雙黃連方藥抗病毒物質基礎研究目的:雙黃連方藥由金銀花、連翹、黃芩配伍而成,是目前臨床治療呼吸道感染性疾病的代表方劑之一療效顯著有三十多年臨床用藥歷史在禽流感、等烈性呼吸道傳染性疾病的治療中也發揮了重要作用,具有清熱解毒,清宣透散之功,現代藥理研究表明雙黃連方藥具有廣譜抗病毒和抗菌效果,但雙黃連的抗病毒物質基礎研究尚不夠充分,制約了該方藥的二次開發,闡明該方藥的抗病毒物質基礎仍是雙黃連方藥繼續向前發展的關鍵所在。方法:（1）高效液相色譜電噴霧串聯質譜法全面分析雙黃連粉針劑及其各組成藥材提取物中化學成分,對其進行初步的定性分析并對其藥味來源進行歸屬。雙黃連粉針為哈爾濱中藥二廠生產,各組成藥材按200版5中國藥典中雙黃連口服液工藝進行提取液質聯用條件為色譜柱柱（x 18流動相A 醋酸水溶液）（甲醇）梯度洗脫? （f） f（） ? C0流速 進樣量M檢測波長 。質譜條件電噴霧電離源（源）碰撞能干燥氣溫度°C干燥氣流速 霧化氣壓力負離子掃描掃描范圍 ?。將各供試液上機分析,對各色譜峰的質譜信號進行分析,對化合物進行初步定性。（2）優選大孔樹脂對雙黃連方藥的組成藥材金銀花、連翹進行大孔樹脂分離,并對各提取分離部位化學成分進行定性分析,對指標成分進行定量分析。（3）以陽性藥物利巴韋林注射液作為對照,對各提取分離部位進行體外抗呼吸道合胞病毒活性評價實驗重復次。藥物毒性實驗方法 細胞常規傳代培養,待長滿后用胰酶消化,含10小%牛血清的培養,待長滿后用胰酶消化,含10小%牛血清的培1養6液4制0成細胞懸液以X個 的細胞密度加入孔板中每孔JC孵相中培養 待細胞長成單層。等體積2%小牛血清的細胞維持液。吸出培養液加入各濃度藥液 M每個濃度個復孔。正常對照只加入7每小時觀察細胞病變情況（）孵箱中培養連續觀察記錄實驗結果。后將藥液吸出每孔加入（用配制）°C孵箱中孵育后棄上清每孔加入室錄0連續觀察記錄實驗結果。后將藥液吸出每孔加入（用配制）°C孵箱中孵育后棄上清每孔加入室錄0溫下振蕩混勻下酶聯免疫檢測儀測定吸光度值并計算細胞存活率。采用1統3計.軟采用1統3計.軟0件回歸將藥物濃度與細胞存活率進行回歸分析,計算細胞半數存活濃度。呼吸道合胞病毒））毒力測定:采用微5毒力測定:采用微5量0法＜用/公式計算藥物抗病毒實驗方法:藥物在無毒濃度范圍內錄用含2小%牛血清的細胞維持液對藥物進行倍比稀釋加入病毒液使病毒濃度為混勻陽性對照藥為利巴韋林注射液（）用細胞維持液稀釋并加入病毒液使利巴韋林終濃度為|J病毒終濃度為于7孵箱中孵育。已長成單層細胞的孔板吸掉培養液每孔接種J各濃度藥液與病毒的混合液每個濃度個復孔同時設陽性對照組病毒對照組和正常對照組C培養后將藥物組和病毒組液體吸出加入細胞維持液繼續培養每日觀察。后記將藥液吸出錄每孔加入l后記將藥液吸出錄每孔加入l用配制）J溫下振蕩混勻在下酶聯免疫檢測儀測定吸光度值。并計算藥物對病毒的抑制率。采用 統計軟件 回歸將藥物濃度與病毒抑制率進行回歸分析計算藥物的半數有效濃度 。并計算治療指數。采用 統計軟件 對各藥物不同濃度組、陽性對照組、病毒對照組、正常對照組間吸光度均數進行方差分析及組間多重比較,確定各藥物組間及其與對照組間病毒抑制率是否有顯著性差異。（4）通過分析抗病毒活性部位成分、對比其與雙黃連粉針中化學成分差異尋找相關抗病毒物質基礎。結果:（1）對雙黃連粉針及各藥材提取物中各色譜峰的質譜信號進行分析,推斷化合物分子量,通過標準品對照、譜圖中碎片離子結構分析及文獻查閱,從雙黃連粉針中共檢測出30個色譜峰,其中鑒定了26個化學成分;從金銀花提取物中檢測出21個色譜峰,鑒定了18個化學成分;從連翹提取物中檢測出23個色譜峰,鑒定了11個化學成分;從黃芩提取物中檢測出5個色譜峰,鑒定了4個化學成分;從金銀花連翹合煎提取物中檢測出24個色譜峰,鑒定了22個化學成分。（2）通過各譜圖間的比較對雙黃連粉針中各色譜峰進行藥味歸屬。雙黃連粉針總離子流圖中共檢測到30個色譜峰,其中14個峰來自金銀花,主要為綠原酸、異綠原酸及其同分異構體等化合物;1個0峰來自連翹,主要為連翹酯苷及其同分異構體等化合物;5個峰來自黃芩,主要為黃芩苷等黃酮類化合物;另有4個峰從各藥味中找不到歸屬,推測可能與以下因素有關:中藥材的化學成分與產地及季節有一定的依賴關系,實驗所用的3個藥材,與雙黃連粉針生產廠所用原料,雖然品種一致,但來源不同,因此在成分上可能存在差異;是生產過程中化合物間的相互作用或分解等產生的新的化合物。對比金銀花提取物,連翹提取物,及金銀花連翹合煎提取物的總離子流圖,發現金銀花單煎提取物中有4個綠原酸的同分異構體,而金銀花連翹合煎只有2個綠原酸的同分異構體,推測可能是綠原酸在合煎條件下比單煎穩定,連翹單煎提取物中的3、4、5、6,1號峰在金銀花連翹合煎提取物中不明顯,說明金銀花連翹合煎與兩藥材單煎在物質基礎上存在一定差異。對比連翹提取物、金銀花連翹合煎提取物及雙黃連粉針的總離子流圖,發現連翹提取物中的9,1號0峰在雙黃連粉針中消失,但在金銀花連翹合煎提取物中能找到這兩個峰的歸屬,說明這兩個峰的消失應該與雙黃連粉針進一步的生產制備工藝有關。兩個峰 。離子均為 推測其應該是連翹酯苷及其同分異構體0考察其分子結構比連翹酯苷多一個羥基可能失去一分子水并發生雙鍵還原反應 而變成在雙黃連粉針中號峰 離子為 為連翹酯苷的同分異構體且從各單味藥中找不到歸屬是否由連翹酯苷反應得來需進一步驗證雙黃連粉針中號峰 為 響應值較高推測其為連翹酯苷在連翹提取物中能找到對應峰但連翹提取物中的 響應值較低本研究認為如果是連翹中已含有的連翹酯苷在雙黃連粉針中的響應值不應該明顯增大測考慮到連翹酯苷分子結構不穩定測容易失去一個咖啡酰基而得到連翹酯苷 因此推測雙黃連粉針中的峰的顯著增大可能由連翹酯苷失去咖啡酰基引起。（）通過以上各譜圖間的對比分析及對各色譜峰的初步定性測可以看出雙黃連粉針是一個非常復雜的化合物組群,其中許多化合物均以同系物或同分異構體的形式存在,首次確定了雙黃連粉針中綠原酸類化合物有3個單咖啡酰奎尼酸的同分異構體（4,7號,峰）和3個雙咖啡酰奎尼酸的同分異構體（17,18號,峰2）2;首次檢測出雙黃連粉針中同時存在著連翹酯苷（為）的個同分異構體（ 號峰）都有相同的碎片離子 推測其由 脫咖啡酰基得來。其中13和18號峰可以在單味連翹提取物及金銀花連翹合煎提取物中找到歸屬目前文獻報道的連翹中分子量為的苯乙醇苷只有連翹酯苷和阿克替苷（ ）兩個（兩個化合物具有相同的母核和取代基但取代基位置不同）經標準品對照確定號峰為連翹酯苷因此號峰應為阿克替苷。號峰則不能從上述組成藥材中找到歸屬是否由連翹酯苷反應得來需進一步實驗驗證。中藥理論認為中藥中通常存在一類結構類似的化合物因共同發揮藥效作用因從此實驗結果可以確認中藥中確實存在著這樣的結構類似的化合物群。同時可以看到全方化學成分絕非各單味藥材化學成分的簡單疊加因在生產過程中因受到工藝條件、化合物間相互作用等各種因素的影響通常有新的化合物產生。在雙黃連粉針、金銀花提取物及金銀花連翹合煎提取物中均存在一個響應值很高的 峰（號峰）經理論推斷和標準品對照證實其為奎尼酸為首次報道雙黃連粉針中存在奎尼酸,奎尼酸應該不是來自綠原酸的水解,而是來源于金銀花。（）經大孔樹脂分離金銀花得到個分離部位A、各部位成分基本無重疊其中部位主要為綠原酸及其同分異構體等成分部位主要為異綠原酸及其同分異構體等成分部位分子量相對較大尚未鑒定出為哪些成分。連翹得到個分離部位A、、、C各部位成分無重疊其中A部位成

分未能鑒定B部位主要為連翹酯苷及其同分異構體、蘆丁等成分部位成分未能鑒定。（5）對各分離部位、黃芩精制物、雙黃連粉針等共10個藥物進行體外抗呼吸道合胞病毒活性篩選結果金銀花部位表現出較好的抗病毒活性 治療指數部位抗病毒活性較弱治療指數 部位未表現出抗病毒活性連翹A部位抗病毒活性較弱 治療指數.部位表現出很好的抗病毒活性優于陽性藥物 治療指數8部位表現出很好的抗病毒活性 治療指數黃芩精制物表現出較好的抗病毒活性 治療指數雙黃連粉針表現出很好的抗病毒活性 治療指數O結論:雙黃連方藥的抗病毒效果應歸功于多成分的協同作用,其中金銀花的分離部位、連翹的B、出部位黃芩精制部位均具有很好的抗病毒活性各部位化學成分研究表明,主要活性成分為奎尼酸、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、番木鱉酸、