培養(yǎng)基的制備與滅菌

目的要求基本原理實(shí)驗(yàn)器材基本步驟培養(yǎng)基的制備與滅菌目的要求1目的要求掌握培養(yǎng)基的配制原理及方法學(xué)習(xí)高壓蒸汽滅菌的基本原理及方法學(xué)習(xí)干熱滅菌的操作技術(shù)目的要求掌握培養(yǎng)基的配制原理及方法2

基本原理（一）

培養(yǎng)基的配制：培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長(zhǎng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。不同種類的培養(yǎng)基中，一般應(yīng)含有碳源、氮源、能源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子和水六大營(yíng)養(yǎng)要素。基本原理（一）

培養(yǎng)基的配制：培養(yǎng)基是人工配制的適合微3

由于微生物營(yíng)養(yǎng)類型復(fù)雜，不同微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求也不一樣，因此，微生物培養(yǎng)基種類繁多。例如按培養(yǎng)的微生物不同可分為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（培養(yǎng)細(xì)菌）、高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基（培養(yǎng)放線菌）和馬丁氏培養(yǎng)基（培養(yǎng)真菌）等；按物理狀態(tài)不同可分為固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基等。配制固體培養(yǎng)基時(shí)需加入1.5%~2.0%的瓊脂作凝固劑。

不同的微生物對(duì)培養(yǎng)基pH要求不同，霉菌和酵母菌的培養(yǎng)基pH一般是偏酸性的，而細(xì)菌和放線菌的培養(yǎng)基pH一般為中性或微堿性。

由于微生物營(yíng)養(yǎng)類型復(fù)雜，不同微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求也4實(shí)驗(yàn)器材儀器或其他用具：搪瓷杯，試管，三角瓶，燒杯，量筒，玻棒，電磁爐、培養(yǎng)基分裝器，高壓蒸汽滅菌鍋，精密pH試紙（pH5.5~9.0），牛角匙，棉花（或橡膠塞），牛皮紙，記號(hào)筆，紗布，棉繩等。

溶液或試劑：牛肉膏，蛋白胨，可溶性淀粉，葡萄糖，NaCl，K2HPO4，KNO3，MgSO4·7H2O，F(xiàn)eSO4·7H2O，瓊脂，孟加拉紅，鏈霉素，1mol/LNaOH，1mol/LHCl等。

實(shí)驗(yàn)器材儀器或其他用具：搪瓷杯，試管，三角瓶，燒杯，量筒，玻5

操作步驟

稱量溶化調(diào)pH過(guò)濾分裝加塞包扎滅菌擱置斜面無(wú)菌檢查操作步驟

稱量溶化調(diào)pH6稱量：按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確地稱取所需藥品逐一放入搪瓷杯中

稱量：按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確地稱取所需藥品逐一放入搪瓷杯中7溶化：在電爐上加熱溶解。溶化：在電爐上加熱溶解。8注：瓊脂要在沸水中溶解，用玻棒不斷攪拌，直至完全溶解（分裝試管）。也可先將一定量的液體培養(yǎng)基分裝于三角燒瓶中，然后按1.5%～2.0%的量將瓊脂直接加入各三角燒瓶中，在高溫滅菌時(shí)即被溶化(分裝三角瓶)。

注：瓊脂要在沸水中溶解，用玻棒不斷攪拌，直至完全溶解（分裝試9分裝：液體培養(yǎng)基分裝試管高度以1/4左右為宜；固體培養(yǎng)基分裝試管高度一般不超過(guò)1/5，滅菌后制成斜面

。分裝：液體培養(yǎng)基分裝試管高度以1/4左右為宜；固體培養(yǎng)基分裝10微生物實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基制備和滅菌ppt課件11加塞加塞12包扎包扎13高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌14擺斜面擺斜面15擱置斜面：最好待培養(yǎng)基冷至50℃-60℃時(shí)擺斜面，以免形成大量冷凝水。擱置時(shí)要調(diào)整斜面的傾斜度，以斜面的長(zhǎng)度不超過(guò)試管總長(zhǎng)的一半（圖示）為宜。可以成扎擺放，凝固前切莫移動(dòng)試管。

試管斜面的擱置與其長(zhǎng)度的示意圖擱置斜面：最好待培養(yǎng)基冷至50℃-60℃時(shí)擺斜面，以免形成大16無(wú)菌檢查：將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃溫箱中培養(yǎng)過(guò)夜，以檢查滅菌是否徹底。

無(wú)菌檢查：將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃溫箱中培養(yǎng)過(guò)夜，以檢查滅菌17基本原理（二）滅菌：是指采用強(qiáng)烈的理化因素使任何物體內(nèi)外部的一切微生物永遠(yuǎn)喪失其生長(zhǎng)繁殖能力的措施。微生物實(shí)驗(yàn)要求在無(wú)菌條件下進(jìn)行，為此，實(shí)驗(yàn)用的器皿、培養(yǎng)基等都要預(yù)先包裝并經(jīng)滅菌后才可使用。微生物實(shí)驗(yàn)中常用的滅菌方法有干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌、紫外線（UV）滅菌和過(guò)濾除菌等，可根據(jù)具體情況選用不同的滅菌方法。

基本原理（二）滅菌：是指采用強(qiáng)烈的理化因素使任何物體內(nèi)外部的18高壓蒸汽滅菌：是將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過(guò)加熱，使滅菌鍋內(nèi)的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡（即排氣），然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時(shí)由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌鍋內(nèi)的壓力，從而使沸點(diǎn)增高，得到高于100℃的溫度，導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。一般采用0.103MPa的蒸汽壓力，此時(shí)溫度是121.1℃，維持15~20min。當(dāng)滅菌物品中有易破壞的成分時(shí)，可采用較低溫度115℃（蒸汽壓力0.075MPa）下維持30min左右.高壓蒸汽滅菌：是將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通19手提式高壓蒸汽滅菌鍋

手提式高壓蒸汽滅菌鍋20圖示手提式滅菌鍋結(jié)構(gòu)1、安全閥；2、壓力表；3、放氣閥；4、軟管；5、螺栓6、滅菌桶；7、篩架；8、水圖示手提式滅菌鍋結(jié)構(gòu)21微生物實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基制備和滅菌ppt課件22微生物實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基制備和滅菌ppt課件23鍋內(nèi)加適量水鍋內(nèi)加適量水24裝入待滅菌物品裝入待滅菌物品25插入排氣軟管；加蓋，旋緊螺栓插入排氣軟管；加蓋，旋緊螺栓26加熱，排氣加熱，排氣27升壓保壓：排氣后，繼續(xù)加熱使鍋內(nèi)蒸汽壓緩慢上升。當(dāng)鍋內(nèi)壓力到達(dá)0.103MPa時(shí)，調(diào)節(jié)熱源開關(guān)，使鍋內(nèi)壓力維持所需滅菌溫度，同時(shí)計(jì)算滅菌時(shí)間。一般培養(yǎng)基和玻璃器皿的滅菌需維持20min。降壓：達(dá)到規(guī)定的滅菌時(shí)間后，關(guān)閉熱源，鍋內(nèi)壓力自然降至零壓后，打開排氣閥排氣。

取料：開啟鍋蓋和取出滅菌物品時(shí)，鍋體表面的溫度仍然很高，逸出的蒸汽也很燙。故取物品時(shí)要防止手及其他部位的皮膚燙傷。

升壓保壓：排氣后，繼續(xù)加熱使鍋內(nèi)蒸汽壓緩慢上升。當(dāng)鍋內(nèi)壓力到28微生物實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基制備和滅菌ppt課件29微生物實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基制備和滅菌ppt課件30

基本原理（三）干熱滅菌：一般在電熱干燥箱中利用熱空氣進(jìn)行滅菌。與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度高（160℃～170℃），時(shí)間長(zhǎng)（1.5～2h）。但干熱滅菌溫度不能超過(guò)180℃，否則包器皿的紙或棉塞就會(huì)烤焦，甚至引起燃燒。干熱滅菌僅適用于對(duì)空的玻璃器皿或金屬器具的消毒滅菌基本原理（三）干熱滅菌：一般在電熱干燥箱中利用熱空氣進(jìn)行滅31微生物實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基制備和滅菌ppt課件32

操作步驟玻璃器皿清洗烘干包裝放入干燥箱165℃，2h關(guān)電源，冷卻操作步驟玻璃器皿清洗烘干包裝33器皿包扎器皿包扎34移液管的包扎及移液管筒移液管的包扎及移液管筒35干熱滅菌干熱滅菌：165℃，1.5~2.0h干熱滅菌干熱滅菌：165℃，1.5~2.0h36實(shí)驗(yàn)安排牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基高氏一號(hào)培養(yǎng)基（同上）馬丁氏培養(yǎng)基（同上）3個(gè)組：各配1000ml，分裝三角瓶（200ml/瓶）

1個(gè)組：配1000ml，分裝三角瓶（150ml/瓶）

2個(gè)組：各配500ml，分裝三角瓶（150ml/瓶）

實(shí)驗(yàn)安排牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基3個(gè)組：各配1000ml，分裝三角37實(shí)驗(yàn)安排（4人/組）

一、器皿包扎和滅菌（1）培養(yǎng)皿12只（