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熒光定量PCR技術專題內容概要熒光定量PCR的原理c熒光定量PCR的標記方法熒光定量PCR解析方法⑦SYBR法實驗流程及注意事項TIANGEN公司熒光定量產品選擇指南熒光定量PCR原理一一定義實時定量PCR技術:利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴増產物量的變化,通過α值和標準曲線的關系對起始模板進行定量分析與常規PCR技術比較對PCR擴增反應的終點產物進行定量和定性分析,無法對起始模板準確定量,無法對擴增反應實時檢測熒光原理一常用公□擴增曲線熒光閾值=Ct值熒光定量PCR原理一一擴增曲線Log-linerphase熒光基團熒光檢測元件cyce(循環數熒光定量PCR原理一一熒光域值前15個循環信號作為熒光本底信號(baseline)Log-linerphase熒光域值的缺省設置是3~15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍手動設置:大于熒光背景值和陰性對照的熒光最高值進入指數期的最初階段真正的信號熒光信號超過域值熒光定量PCR原理一一G值Ct值的定義PCR擴增過程中,擴增Ctvalue產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過的擴增循環次數Cycle(循環數熒光定量PCR原理一一C值與模板起始量的關系更1R”T□模板DNA量越多,熒光達到域值的循環數越少,即Ct值越小Log模板起始濃度與Ct值呈線性關系。ogofDnaconcentration熒光定量PCR反應性的確認線性關系、擴增效率確認相關系數(r2):大于098PCR擴增效率(E):0.8-12檢測靈敏度確認35Cycles內可得到好的定量結果如果采用SYBR檢測方法,30ycles內無非特異性產物擴增Notemplatecontro確認35Cycles內無引物二聚體產生熒光定量PCR技術的應用定性分析研究:雜合或純合子鑒定,(SNPs)分析等絕對定量研究:病毒和病原菌定量分析,基因拷貝數定量,GMO定量檢測等戇相對

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