野生冬蟲夏草與人工冬蟲夏草蛋白組差異研究王藝璇摘

要冬蟲夏草Ophiocordycepssinensis是麥角菌科冬蟲夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的干燥復合體。具有“補腎益肺，止咳化痰”之功效，是一種名貴中藥。由于其生理生化的特殊性和復雜性，目前其子實體形成機制研究得并不明確。本研究利用Illumina/SolexaHiSeq2500反轉錄測序技術對冬蟲夏草子實體、菌絲體及小金蝠蛾幼蟲轉錄組進行測序、數據組裝、分析，發現冬蟲夏草菌絲體、子實體與冬蟲夏草具有高同源性，而小金蝠蛾幼蟲與其他樣品的同源性很低；差異表達分析發現9238個基因在冬蟲夏草菌絲體、子實體中均有表達，這相當于

72.57％的重合度；經鑒定，1003個基因為DEGs（差異表達基因），KEGG富集分析顯示這些DEGs富含核糖體途徑；有161個差異表達基因參與豐富了GO

術語。子實體中有58個差異表達基因下調，103個差異表達基因上調，表明冬蟲夏草蛋白質合成的基本代謝在冬蟲夏草菌感染小金蝠蛾幼蟲后發生了改變，以及47個基因特異表達；還發現肌動蛋白和微管蛋白相關基因表達的改變可能在子實體發育中起作用。這些結果均與冬蟲夏草子實體形成相關。同時利用2-DE（雙向電泳）技術對冬蟲夏草的發育過程中的三個階段（菌蟲復合體、子座、整體）的蛋白質組進行分析，篩選出5個穩定存在的蛋白質和3個具有顯著差異的蛋白質，這8種蛋白質均在子座形成后出現。通過質譜技術進一步鑒定了這8個蛋白質，對其進行功能注釋分析(GO、KEGG)后發現，3個具有顯著差異的蛋白質斑點1、斑點5、斑點6均與細胞構成相關，其中斑點1參與大量核苷酸結合和酶活性過程，斑點5參與了大量代謝過程和化合物結合過程，斑點6參與了大量代謝過程和細胞生長過程；5個穩定存在的蛋白質中斑點2、斑點3與刺激應答、核苷三磷酸酶結合相關，斑點4與有機氮化合物代謝、離子結合相關，斑點7與生物調節和水解酶活性相關，斑點8與物質運輸和轉錄合成相關。斑點1鑒定為肌動蛋白，GO注釋發現該蛋白大量參與了細胞、細胞區域、細胞組分、細胞內、細胞內部分等過程，KEGG通路富集分析發現其活躍的代謝途徑為磷脂酰肌醇信號系統、吞噬小體，提示肌動蛋白可能在冬蟲夏草的生長發育中其重要作用。1還通過2-DE（雙向電泳）技術對野生冬蟲夏草整體、菌蟲復合體、子座及人工冬蟲夏草整體、菌蟲復合體、子座的蛋白質組進行對比分析，篩選出野生冬蟲夏草特有的蛋白質，驗證了課題組前期冬蟲夏草正偽品指標性蛋白質，并基于蛋白質層面揭示了野生冬蟲夏草與人工培育冬蟲夏草間的差異，為后續野生冬蟲夏草與人工冬蟲夏草的鑒別研究奠定了基礎。關鍵詞：冬蟲夏草；轉錄組；蛋白組；指標性蛋白質；發育前言冬蟲夏草Ophiocordycepssinensis為麥角菌科真菌侵染蝙蝠蛾科多種幼蟲后

形成的菌蟲復合體，是我國傳統名貴中藥[1]。具有免疫調節、抗菌、抗腫瘤、抗

氧化、抗衰老、降血糖血脂等廣泛的藥理作用，與人參、鹿茸并稱“三大補藥”[2,3,4]。中國是冬蟲夏草最主要的分布地，占全球冬蟲夏草分布面積的90%以上，

主要分布于西藏、青海、四川、云南和甘肅等省3000~5200m的高海拔地區[5,6,7]。近年來由于全球氣候變暖和青藏高原生態環境的變化，冬蟲夏草的野生資源日趨

減少。同時由于冬蟲夏草特殊的藥理作用，使其在藥用、保健等方面的用量日益

增加，國內外市場需求量日漸攀升高，冬蟲夏草的人工培育成為研究熱點[8]。目

前對冬蟲夏草人工培育的研究主要集中真菌分離、幼蟲繁殖、侵染三個階段，相

對比較成熟，但主要問題在于侵染后子座形成率低，這是困擾冬蟲夏草人工培育

的技術關鍵[9,10,11]，由于冬蟲夏草生長環境特殊、周期長，關于冬蟲夏草形成機

制的關鍵階段——子實體形成的研究較少，至今未有明確報道，亟待利用新方法

進行研究，為后續野生撫育、人工培育提供科學依據。同時目前市場有一定量的人工冬蟲夏草以野生冬蟲夏草形式流通，二者生長周期差異較大，外觀相似度高，課題組前期發現其成分差異較大，缺乏必要的鑒別手段，亟待尋找鑒別點，建立新的鑒別方法。在生物學研究中以表征全部基因的表達情況為目的的研究被稱為轉錄組表達譜研究，相應的以表征全部蛋白質表達情況為目的的研究被稱為蛋白質組表達譜研究[12]。生物在遭受某種刺激或病變時往往會伴隨著某些基因或蛋白質表達量的變化，其中有些變化是引起生物體變化的原因，有些則是生物體變化的結果[13]。在生物系統中，基因組是遺傳信息的儲存體，mRNA（轉錄組）是基因表達的中間體，功能性蛋白質（蛋白質組）是基因功能的執行體[14]。因此基因組和轉錄組之間理所當然的存在不對應關系，而mRNA和蛋白質則是基因表達中兩個不同階段產物。為了深入研究冬蟲夏草的生長發育過程，挖掘與冬蟲夏草的形成、功效相關的物質，本研究將冬蟲夏草轉錄組與蛋白質組相結合，旨在發現冬蟲夏草轉錄組與蛋白質組之間的相關性，為研究冬蟲夏草的生長發育過程提供資料。第二代轉錄組測序技術主要分別為羅氏454焦磷酸測序技術[15]、Illumina/Solexa

聚合酶合成測序[16]以及ABI/SOLiD

連接酶測序技術[17]三種。而Illumina/Solexa

測序技術具有測序通量大，測序質量高的優勢。本研究采用Illumina/SolexaHiSeq2500高通量測序平臺對冬蟲夏草子實體、菌絲體及小金蝠蛾幼蟲轉錄組進行測序分析，通過數據庫與冬蟲夏草轉錄組序列進行對，預測與冬蟲夏草生長發育相關基因。本課題組前期已經利用蛋白質嚴格的種屬特異性和組織特異性，與不同品種間在凝膠圖譜中具有差異蛋白譜帶的特點，采用雙向電泳技術(2-DE)分離冬蟲夏草蛋白，獲得冬蟲夏草正偽品電泳圖譜，得到88個冬蟲夏草共有蛋白質，篩選了26個差異蛋白斑點作為冬蟲夏草指標性蛋白質，可定性鑒別冬蟲夏草[18]。本課題在此基礎上，通過對比分析野生冬蟲夏草發育過程中的三個階段（菌蟲復合體、子座、整體）蛋白質圖譜，篩選出發育過程中穩定存在的蛋白質和具有顯著差異的蛋白質，并結合LC-MS/MS和數據庫搜索對其進行生物功能分析，同時驗證了前期冬蟲夏草指標性蛋白質。對野生冬蟲夏草整體、菌蟲復合體、子座及人工冬蟲夏草整體、菌蟲復合體、子座的蛋白質組進行分析，篩選出野生冬蟲夏草及人工冬蟲夏草差異性蛋白質，驗證前期冬蟲夏草指標性蛋白質并在蛋白質層面揭示了野生冬蟲夏草與人工培育冬蟲夏草的差異，為后續研究奠定基礎。研究內容2.1冬蟲夏草子實體、菌絲體及小金蝠蛾幼蟲轉錄組分析2.2冬蟲夏草各個發育階段蛋白質組分析2.3冬蟲夏草發育階段差異蛋白質的鑒定與分析2.4

野生冬蟲夏草、人工冬蟲夏草蛋白質組分析技術路線：轉錄組技術路線圖：蛋白質組技術路線圖：差異蛋白質尋找技術路線：3.4.2人工冬蟲夏草子座、人工冬蟲夏草菌蟲復合體、人工冬蟲夏草差異蛋白第一章冬蟲夏草轉錄組分析轉錄組是指特定生物體在某種狀態下所有基因轉錄產物的總和，轉錄組研究屬于功能基因組學研究的范疇，是連接基因組與蛋白質組的紐帶。轉錄組研究著重于功能基因的表達，闡述生物學過程中的分子機理[19]。西洋參P.quinquefolius[20]是目前應用最廣泛的傳統中藥材之一，也是較早開展轉錄組研究的中藥材。西洋參轉錄組的研究采用了454GSFLXTMTita-niumSystem

平臺，得到了209747條高質量序列，平均讀長427個堿基，數據組裝得到16592

條contig和14496

singleton。通過Nr庫注釋，得到21684個基因。通過KEGG通路注釋，發現西洋參的轉錄組中包含了甾醇骨架合成通路、油菜素類固醇合成通路和豆甾醇合成通路的所有基因。本部分研究通過二代轉錄測序技術Illumina/SolexaHiSeq2500測序技術獲得冬蟲夏草子實體、菌絲體及小金蝠蛾幼蟲轉錄組序列，對所得序列進行Unigene

功能注釋、GO分類和差異表達分析，運用序列對比程序對冬蟲夏草菌絲體、子實體、小金蝠蛾幼蟲及冬蟲夏草進行兩兩比較，發現冬蟲夏草菌絲體、子實體和冬蟲夏草具有高同源性，而小金蝠蛾幼蟲與其他樣品的同源性很低；在對161

個差異表達基因GO分析后發現，子實體中有58個基因下調，另外103個基因上調，表明在冬蟲夏草菌感染小金蝠蛾幼蟲后冬蟲夏草蛋白質合成的基本代謝發生了改變，同時發現肌動蛋白基因MSTRG.3317的表達水平在冬蟲夏草中下調，微管蛋白相關基因MSTRG.3823，MSTRG.6894的表達水平均在子實體中上調，表明肌動蛋白和微管蛋白相關基因表達的改變可能在子實體發育中起作用。這些結果均與冬蟲夏草的發育相關，為冬蟲夏草的發育研究提供了資料。1儀器與材料1.1儀器立式壓力蒸汽滅菌器(YXQ-LS-75SII)、電熱鼓風干燥箱(GZX-9240MBE)均購自上海博訊實業有限公司。T100TM(ThermalCycler)、凝膠成像系統購自BIO-RAD；高速冷凍離心機(ST16R)、超低溫冰箱905、紫外分光光度計(NanoDrop2000)購自ThermoFisherScientific；優普系列超純水器(UPH-II-10)購自成都超純科技有限公司；HiSeq2500測序儀(IMS-20，Illumina/Solexa)、超凈工作臺（SW-CJ-2D,

蘇凈安泰）1.2試劑PureLink?PlantRNAReagent(Ambion,

美國)，Trizol試劑(Invitrogen公司)，TransStartFastPruFlyDNAPolymerase(全式金，北京)，Trans2KPlusDNAMarker

（全式金，北京），RTreagentKitwithgDNAEraser（Takara,

日本），轉錄組高通量測序由北京百邁克生物技術有限公司完成。1.3樣品冬蟲夏草菌絲體Hirsutellahepiali

、新鮮冬蟲夏草子實體Ophiocordycepssinensis、小金蝠蛾幼蟲Hepialusxiaojinensis經成都中醫藥大學國錦琳教授鑒定分別為冬蟲夏草菌絲體、新鮮冬蟲夏草子實體、小金蝠蛾幼蟲。樣品備份于成都中醫藥大學中藥材標準化教育部重點實驗室。2方法2.1人工冬蟲夏子實體、菌絲體、小金蝠蛾幼蟲RNA提取2.1.1冬蟲夏草子實體、菌絲體RNA的提取（按PureLink?PlantRNAReagent試劑盒說明書操作）取100mg新鮮樣品在液氮中充分研磨（研磨要迅速，最好不要超過1min），加入0.5m預冷PureLink?植物RNA試劑，渦旋混合或輕彈試管底部，至樣品

充分重懸。室溫孵育5min。室溫離心，12000×g，2min，轉移上清液至無RNA

酶的1.5mLEP管。向提取物中加入0.1mL5MNaCl，輕輕混勻。再加入0.3mL

三氯甲烷，顛倒試管混勻。4℃離心，12000×g，10min，將上層水相轉移至無

RNA酶的1.5mLEP管中。向水相中加入等體積的異丙醇，混合均勻，并在室

溫下靜置10min。再次離心10min。棄上清液，向沉淀中加入1mL75%乙醇。

室溫離心，12000×g，1min，棄上清液，小心不要丟失沉淀，短暫離心收集殘余

液體，并用移液管取出。RNA沉淀中加入10～30LRNase-Free水，反復吹打

以重懸RNA，如果觀察到任何渾濁，將溶液在室溫下以12000×g離心1min，并

將含有RNA的上清液轉移至無RNA酶的1.5mLEP管中，將純化的RNA儲存

在-70

℃。2.1.2小金蝠蛾幼蟲RNA的提取（按Trizol試劑盒說明書操作）2取25-30mg小金蝠蛾幼蟲樣品放于勻漿器中，加入液氮研磨，然后加入1mL

Trizol試劑勻漿，至無明顯組織碎片，將勻漿液轉入EP管中。4℃,12000×g離心15min，將上清液轉入新的EP管中。上清液15-30℃溫育5min后加入0.2mL

氯仿，用力搖勻15s左右，于15-30℃溫育5min。再次離心20min(4℃,12000×g)，用移液槍小心將上層水相轉移到新EP管中（槍頭勿吸入沉淀），加入0.5mL

異丙醇輕輕混勻，沉淀RNA，15-30℃溫育10min。離心10min(4℃,12000×g)，棄上清，用1mL75％乙醇清洗2次。渦旋振蕩樣品，4℃，7500×g離心5min。于超凈工作臺內干燥8min左右，加30μLRNase-free水，用槍頭吸打混勻，55℃溫育10min，-70℃貯存備用。2.2冬蟲夏草子實體、菌絲體及小金蝠蛾幼蟲轉錄組測序及分析2.2.1轉錄組測序提取冬蟲夏草菌絲體(HH-1、HH-2)、子實體(CS-1、CS-2)、小金蝠蛾幼蟲(HX-1，HX-2)總RNA，用Agilent2100Bioanalyzer

檢測RNA提取質量，建好測序文庫，用IlluminaHiSeq2500

進行測序，不同樣品分別做2個平行，以消除個體誤差。2.2.2短讀序組裝用短讀序組裝程序Trinity對冬蟲夏草菌絲體、子實體、及冬蟲夏草的cleanreads進行從頭組裝，利用Nr，Swiss-Prot，KEGG和COG數據庫和軟件ESTScan預測基因蛋白質編碼區[21]，并決定其序列方向，并將得到的原始圖像數據經basecalling

轉化為序列數據，稱為原始讀序，以fastq

格式儲存，提交到NCBI

序列讀取存檔。2.2.3測序質量評估以FastQC軟件評估6個樣本的測序Read質量、GC含量等，發現6個樣本RNA-Seq質量較高，可用于進一步的denovo組裝、功能注釋及差異表達基因挖掘等分析。2.2.4Unigene功能注釋、GO分類分析用Blastx

將Unigene

序列到蛋白數據庫Nr，Swiss-Prot,

KEGG

和KOG(E3碼序列及gDNA序列，用Sanger

測序技術對所克隆基因重測序，并將其與轉錄組組裝序列做Blast比對分析，以確定所克隆序列的正確性。依據現有研究成果挖掘相關基因及差異分析。將轉錄組測序得到的實驗結果利用real-timePCR進行驗證。3結果與討論3.1轉錄組測序以FastQC軟件評估6個樣本的測序Read質量、GC含量等，發現6個樣本RNA-Seq質量較高，可用于進一步的GO功能注釋分析、差異表達基因分析等研究。去除掉質量差的后，分別從冬蟲夏草菌絲體、子實體及小金蝠蛾幼蟲中得到了約125bp長的72898546，69048056和62543256條cleanreads。3.2短讀序組裝檢

索

了

保

存

在

The

Sequence

Read

Archive(SRA,

http://

/Traces/sra/sra.cgi？)

中的冬蟲夏草O.sinensis（命名為SRR）的RNA-Seq讀段并從冬蟲夏草菌絲體、子實體、冬蟲夏草的cleanreads

中篩選了22524、26534和30132個unigenes。運用序列對比程序對冬蟲夏草菌絲體、子實體、小金蝠蛾幼蟲及冬蟲夏草進行兩兩比較，發現冬蟲夏草菌絲體、子實體和冬蟲夏草具有高同源性，而小金蝠蛾幼蟲與其他樣品的同源性很低。用短讀序組裝程序Trinity對冬蟲夏草菌絲體、子實體及冬蟲夏草的cleanreads進行從頭組裝，總共有34152個unigenes(

≥200bp)被組裝。為了全面表征不同RNA-Seq樣品的表達模式，檢查個體轉錄組是如何相關的，通過主成分分析(PCA)進一步分析34152個unigenes的全局表達模式。結果顯示冬蟲夏草菌絲體/冬蟲夏草/子實體組與小金蝠蛾幼蟲組之間有明確的分離，生物學上具有良好的重復性（圖1A），與BLAT結果一致。表明冬蟲夏草的子實體可能具有與菌絲體相似的轉錄組。4圖1.從冬蟲夏草菌絲體和子實體獲取的四個樣本的KOG分類和表達分析A：裝配基因的KOG分類;B：六個樣品RNA-Seq的主成分分析;C：表達轉錄本的維恩圖。Figure.1.KOGclassificationandexpressionanalysisoffoursamplesfrommyceliumandFruitingbodyofOphiocordycepssinensis.A:KOGclassificationofassemblygenes;B:principalcomponentanalysisofRNA-seqinsixsamples;C:Venndiagramexpressingtranscripts.3.3差異表達和功能富集分析將冬蟲夏草菌絲體組和子實體組的所有RNA-SeqPE讀數分別與O.sinensis

CO18(/assembly/GCA_000448365.1/)的基因組序列比對，并由StringTie組裝。總共組裝了11264個基因組編碼基因和233個新基因。為了全面表征不同樣品RNA-Seq的表達模式，將每個基因的比對讀數的數量標準化，結果發現，9238個基因在冬蟲夏草菌絲體、子實體、小金蝠蛾幼蟲及冬蟲夏草中均有表達，這相當于72.57％的重合度（圖1B）。經鑒定，1003個基因為DEGs。KEGG富集分析顯示這些DEGs富含核糖體途徑。背景轉錄組中共有33個基因參與了該途徑，其中24個基因在子實體和菌絲體組之間差異表達。GO富集也證實了這一結果。DEGs的主要GO術語包括大分子復合物（102個基因），有機物質生物合成過程（88個基因），生物合成過程（88個基因），細胞生物合成過程（81個基因）和有機氮化合物代謝過程（81個基因），見圖2。DEGs的富集分析發現劇烈變化的基因主要富集在核糖體的結構成分、核糖體亞基、蛋白酶體核心復合體、MCM復合體、核糖核蛋白復合體途徑。有161個差異表達基因參與豐富了GO術語。子實體中有58個基因下調，另外103個基因上調。這些結果表明，冬蟲夏草蛋白質合成的基本代謝在冬蟲夏草菌感染小金蝠蛾幼蟲后發生改變。分析發現冬蟲夏草中還有47個基因特異表達（特異表達基因，SEG），包括非核糖體肽合成酶，細胞色素P450，HSP70家族伴侶，乙醛酸酶家族蛋白，細胞壁相關蛋白，乙醛酸酶家族蛋白和推定的琥珀酰-CoA連接酶編碼基因。GO分類結果表明，有8個特異表達基因與細胞部分相關。并且有62個基因在菌絲體中特異性表達，包括膜聯蛋白，核糖體RNA加工蛋白12編碼基因。圖2差異表達轉錄本的GO分類Figure2.GOclassificationofdifferentiallyexpressedtranscripts3.4子實體發育涉及基因子實體發育是一個由多基因控制的復雜的細胞分化過程。實驗發現與菌絲體（HH-1和HH-2）相比，冬蟲夏草子實體（CS-1和CS-2）中有一些特征性的子實體發育相關基因表達上調。Ndk-1和sod-1基因在光形態發生的某些方面起著至關重要的作用。Ndk-1編碼一個核苷二磷酸激酶，參與了生物體中的光信號轉導通路。MSTRG.2107編碼核苷二磷酸激酶，冬蟲夏草子實體樣品的表達水平顯著高于HH。Sod-1編碼超氧化物歧化酶。MSTRG.2218，MSTRG.5467，MSTRG.5954和MSTRG.69514在內的4個sod-1基因在子實體和菌絲體中的表達均有明顯變化。表達最高的sod-1基因MSTRG.5954在冬蟲夏草子實體中表達水平為1608.88，而在菌絲體中表達水平為198.95，下降了8.09倍。MSTRG.5094和MSTRG.5858編碼異源三聚體G蛋白的β亞基子實體樣本中這兩個基因的表達也高于菌絲體樣本。Nrc-2，vma-1，cel-2和car1是一些涉及形成子囊殼，初生孢子囊或子囊孢子的關鍵基因。子實體樣本中這些基因的表達水平也高于菌絲體樣本。根據GO注釋，MSTRG.8670和MSTRG.16參與有性生殖和主要性特征的發展途徑。子實體中這兩個基因表達豐度均上調。李翔等[22]發現了121個可能參與子實體發育的候選基因。我們鑒定了81個與這121個候選基因具有高度序列同一性(95％)的基因（圖3）。在81個基因中，有25個基因在log2FC≥1時表現出明顯的表達變化，但只有12個基因發生log2FC≤-1變化。圖3子實體發育候選基因的表達模式。根據HemI工具包的log2FC值繪制熱圖。根據每個基因的表達水平計算CS樣品組和HH樣品組之間的Log2FC。3.5肌動蛋白和微管蛋白相關基因肌動蛋白基因(MSTRG.3317)的表達水平在冬蟲夏草中下調。子實體樣本組平均表達豐度為45.25，菌絲體組平均表達豐度為155.24。冬蟲夏草中存在2個微管蛋白/FtsZ蛋白編碼基因(MSTRG.3823，MSTRG.6894)。MSTRG.3823為微管蛋白/FtsZ家族蛋白(EQL01373.1)編碼序列。子實體和菌絲體樣本組中基因的平均表達水平分別為1748.13和574.04。MSTRG.6894為微管蛋白FtsZ基因。該基因表達從菌絲體組的27.18上調至子實體組的78.95。表明，肌動蛋白和微管蛋白相關基因表達的改變可能在子實體發育中起作用。4小結對人工培育的冬蟲夏草子實體及菌絲體、小金蝠蛾幼蟲進行高通量的測序，驗證發現測序結果良好。對轉錄組數據比對到已知的冬蟲夏草基因組上，比對結果良好。表明冬蟲夏草菌絲體、子實體和冬蟲夏草具有高同源性，而小金蝠蛾幼蟲與其他樣品的同源性很低。鑒定在冬蟲夏草菌絲體、子實體、小金蝠蛾幼蟲及冬蟲夏草中均有表達的差異表達基因，進行GO，KEGG分析發現這些基因活躍的細胞活動或是通路。深入分析子實體時期的差異表達基因。發現與菌絲體相比，冬蟲夏草子實體中有一些特征性的子實體發育相關基因表達上調。4個sod-1基因MSTRG.2218，MSTRG.5467，MSTRG.5954和MSTRG.69514在子實體和菌絲體中的表達均有明顯變化。表達最高的sod-1基因MSTRG.5954在菌絲體中表達水平比在冬蟲夏草子實體中表達水平下降了8.09倍。根據GO注釋，MSTRG.8670和MSTRG.16均參與了有性生殖和主要性特征的發展途徑。而子實體中這兩個基因表達豐度均有上調。肌動蛋白基因(MSTRG.3317)的表達水平在冬蟲夏草中下調，微管蛋白相關基因(MSTRG.3823,MSTRG.6894)的表達水平均在子實體中上調，表明，肌動蛋白和微管蛋白相關基因表達的改變可能在子實體發育中起作用。為冬蟲夏草的發育研宄提供數據支持。第二章冬蟲夏草不同發育階段蛋白組分析20世紀90年代澳大利亞學者MarcWilkins與KeithWilliams首先提出蛋白質組學的概念[23]。其研究的基本對象即蛋白質——能囊括一個細胞乃至整個生物體所表達的全部蛋白質。而差異蛋白質組學是對某個體系的蛋白質進行鑒定，并詳細闡述其翻譯后修飾的特性差異的蛋白質組學，即以重要生命過程或人類重大疾病為對象，進行重要生理和病理體系或過程的蛋白質表達的比較，通過各種先進技術研究蛋白質之間的相互作用，繪制某個體系的蛋白質作用的網絡圖譜[24]。在疾病的早期診斷、病程及療效監測、環境因素影響分析等方面的應用價值是不言而喻的。Petricoin等[25]應用C16芯片對卵巢癌患者和正常對照者血清中進行研究，結果發現在質荷比值為534、989、2111、2251和2465處5個峰的同時變化對于診斷具有重要意義，進行簇分(clusteranalysis)，建立了一種簇分模型(cluster

pattern，能有效地篩查卵巢癌風險人群，其敏感性達100%，特異性達95%，陽性預期值達94%，遠優于CA125。Salekdeh等[26]研究了兩個水稻品種（CT9993

和IR62266）干旱脅迫和復水10d后的葉片蛋白質組變化。在1000多個凝膠蛋白點上發現42個蛋白點的豐度在干旱脅迫下變化顯著。復水后，所有蛋白點的豐度完全或非常接近處理前。在經質譜鑒定的16個與水分脅迫的相關蛋白中，4個是與干旱脅迫相關的蛋白及與之相對應的響應干旱的機制。本研究應用雙向電泳技術對冬蟲夏草發育過程中的三個階段（菌蟲復合體、子座、整體）的蛋白質組進行分析，篩選出穩定存在的蛋白質和具有顯著差異的蛋白質，驗證前期冬蟲夏草指標性蛋白質并為后續研究奠定基礎。1儀器與材料1.1儀器低溫高速離心機：貝克曼X-22R型雙向電泳系統：Bio-Rad公司凝膠掃描成像系統：

Bio-Rad公司電熱恒溫鼓風干燥箱：上海島韓實業公司DHG-9035A型1.2藥材人工冬蟲夏草、小金蝠蛾幼蟲樣品于2017年采自四川省阿壩州小金縣經成都中醫藥大學國錦琳教授鑒定為人工冬蟲夏草、小金蝠蛾幼蟲，留樣標本存放于成都中醫藥大學中藥材標準化教育部重點實驗室。1.3試劑聚丙烯酰胺預混液、甘氨酸、BSA（純度≥99%）、Tris堿、CHAPS、碘乙酰胺、TEMED、SDS、尿素、過硫酸銨、覆蓋瓊脂糖、QuickStart?Bradford1x

DyeReagent、分離膠緩沖液、濃縮膠緩沖液、IPG膠條(17cm，pH3-10)、Bio-Lyte

(pH3-10)、DTT、PrecisionPlusProtein?

預染標準品、礦物油均購自Bio-Rad公司；PMSF、AP、考馬斯亮藍R-250、低熔點瓊脂糖、溴酚藍、-巰基乙醇、Tween-80、購自鵬程生物科技有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、TCA、丙酮、甲醇、冰乙酸購自成都科龍化工試劑廠，均為分析純；水為去離子水。1.4主要試劑配置PBS緩沖液(0.02mol/L,pH=7.2)：5.16gNa2HPO4，0.87gNaH2PO4，超純水溶解定容至100mL。蛋白質提取液：PBS緩沖液(0.02mol/L,pH=7.2)，0.2%Tween80，0.2%β-巰基乙醇，1mMPMSF。10%TCA-丙酮：20gTCA，0.14gDTT，加丙酮溶解，定容至200mL，-20℃預冷。10%SDS：10gSDS，少量超純水加熱溶解，定容至100mL，混勻，室溫保存。10%APS：0.1gAPS，用時加入1mL超純水溶解，4℃保存。10×電泳緩沖液(10×=25mMTris,192mM

甘氨酸，0.1%SDS,pH8.3)：30gTris堿，144g甘氨酸，10gSDS，適量超純水溶解，定容至1000mL，混勻后室溫保存。膠條平衡緩沖液母液：72g尿素，4gSDS，適量超純水溶解，加入50mL

Tris-HCl(1.5MpH8.8Tris-HCl)，20mL甘油，定容至100mL。分裝，-20℃保存。水化上樣緩沖液：4.2g尿素，1.52g硫脲，0.4gCHAPS，0.098gDTT，適量超純水溶解，加入50L40%Bio-Lyte，10L溴酚藍(1%)，超純水定容至10mL。分裝，-20℃保存。膠條平衡緩沖液I：0.2gDTT，10mL膠條平衡緩沖液母液，充分混勻，用時現配。膠條平衡緩沖液II：0.2g碘乙酰胺，10mL膠條平衡緩沖液母液，充分混勻，用時現配。2實驗方法2.1冬蟲夏草、菌絲體及蟲體蛋白質的提取2.1.1蛋白質的提取取樣品粉末約0.2g，加入0.02mol?L-1PBS

緩沖液(pH7.2)5mL(1%PMSF)，充分研磨至糊狀，4℃浸提過夜。取出離心，4℃，13000rpm，30min，重復離心，收集上清液。2.1.2蛋白質的保存將2.1.1得到的上清液用Bradford[27]法測定其含量，用0.22微米的微孔濾膜膜除菌，無菌分裝于0.5mLEP中，進行標記，置4oC保存備用。2.2蛋白質含量測定2.2.1標準曲線制備配制BSA標準溶液(1mg/mL)，按下表制作蛋白質定量標準曲線，用紫外分光光度計檢測OD595并記錄。表1.Bradford法蛋白質定量標準曲線的制備Table1.Preparationofastandardcurveforproteinquantification圖4

Bradford法測定冬蟲夏草蛋白含量標準曲線

Figure.4StandardcurveofOphiocordycepssinensisproteincontentdeterminedbyBradfordmethod2.2.2樣品含量測定取2.1.1項下蛋白粗提液50uL，采用2.2.1項進行蛋白質含量測定。2.3蛋白質純化（TCA-丙酮沉淀蛋白[28]）取2.1.1項下蛋白粗提取液，加入10倍體積TCA-丙酮(10%TCA,0.07%DTT)，漩渦混合后于-20℃靜置1h，離心，10min，13000rpm，棄去上清液；加入-20℃預冷丙酮洗滌4次，室溫自然干燥后水化用上樣緩沖液溶解，低溫震搖1h，離心取上清液，再次離心，取上清液保存備用。2.4雙向電泳凝膠[28][29]采用2.3.1項蛋白質樣品，上樣量為600μg。第一向以不搭鹽橋的方式進行水化，設置水化溫度20℃，被動水化12~16h。第二向SDS參照郭堯君[30]方法，凝膠濃度12%T，電泳過程起始采用低電流10mA/gel，一小時后改變電流為30mA/gel，待溴酚藍指示劑達到底部邊緣時停止電泳。2.5染色電泳結束后采用考馬斯亮藍法（0.1%考馬斯亮藍R250，45%甲醇，10%冰乙酸）染色，過夜，脫色液（10%甲醇，10%冰乙酸）搖床脫色至背景脫色干凈。2.6凝膠掃描及圖像分析用ImagescanerII透射掃描儀對凝膠進行掃描，分辨率為150dpi，保存圖像。使用PDQUESTTMBasic(Bio-Rad)和SPSS進行圖像和數據的處理分析。3結果3.1蛋白質含量分析表2

不同來源冬蟲夏草蛋白質含量(n=3)Table2ProteincontentofOphiocordycepssinensisfromdifferentsources(n=3)P＞0.053.2蛋白質斑點數量分析表3

不同來源冬蟲夏草蛋白斑點數(n=3)Table3

proteinspotsofOphiocordycepssinensisfromdifferentsources(n=3)P＞0.053.3冬蟲夏草及偽品差異斑點驗證圖5.前期課題組鑒定正偽品26個差異蛋白Figure5.Earlyidentificationof26authenticityproductsinthestudygroup圖6.人工冬蟲夏草驗證得到20個差異蛋白Figure6.Verificationof20differentialproteinsbyartificialOphiocordycepssinensis圖7.人工冬蟲夏草子座驗證得到14個差異蛋白Figure7.Verificationof14differentialproteinsbyartificialOphiocordycepssinensisstroma3.4差異蛋白分析3.4.1人工冬蟲夏草、小金蝠蛾幼蟲差異蛋白分析利用PDQUESTTMBasic軟件對冬蟲夏草圖譜進行匹配分析后，建立人工冬蟲夏草共有蛋白凝膠作為參照膠，以小金蝠蛾幼蟲圖譜為分析膠進行組間匹配，進行差異表達分析后得到感光度sensity=3.0的差異表達蛋白點。結果顯示，在人工冬蟲夏草與小金蝠蛾幼蟲的對比分析中，人工冬蟲夏草與小金蝠蛾幼蟲存在共有蛋白斑點7個，如圖10。圖10.人工蟲草與小金蝠蛾幼蟲共有的蛋白Figure10.ProteinsSharedbytheartificialOphiocordycepssinensisandthelarvaofHepialusxiaojinensis3.4.2人工冬蟲夏草子座、人工冬蟲夏草菌蟲復合體、人工冬蟲夏草差異蛋白分析利用PDQUESTTMBasic軟件對冬蟲夏草圖譜進行匹配分析后，建立人工冬蟲夏草共有蛋白凝膠作為參照膠，以人工冬蟲夏草菌蟲復合體、人工冬蟲夏草子座圖譜為分析膠進行組間匹配，進行差異表達分析后得到感光度sensity=3.0的差異表達蛋白點。結果顯示，在人工冬蟲夏草與人工冬蟲夏草子座、人工冬蟲夏草菌蟲復合體的對比分析中，三者存在共有蛋白斑點34個，如圖11；在人工冬蟲夏草子座-人工冬蟲夏草菌蟲復合體-人工冬蟲夏草這一生長發育過程中，冬蟲夏草整體僅與人工冬蟲夏草菌蟲復合體共有蛋白35個，僅與人工冬蟲夏草子座共有的蛋白4個，如圖12；成為人工冬蟲夏草整體后，對比前兩個階段新產生蛋白14個，如圖13；最終篩選出8個表達量大、穩定，斑點清晰的蛋白質點，其中新產生蛋白3個，穩定存在斑點5個進行后續研究，如圖14。圖11.人工冬蟲夏草子座、人工冬蟲夏草菌蟲復合體、人工冬蟲夏草共有的蛋白Figure11.ProteinsharedbytheartificialOphiocordycepssinensis,mycoticcomplexofOphiocordycepssinensisandthelarvaofHepialusxiaojinensis17圖12.圓形表示人工冬蟲夏草僅與菌蟲復合體共有的蛋白，方形標記僅與子座共有的蛋白Figure12.CirclesindicatethatartificialOphiocordycepssinensisonlysharesproteinwiththeOphiocordycepssinensis,andsquaremarksonlyshareproteinswiththestroma.圖13.僅在人工冬蟲夏草中存在的蛋白Figure13.ProteinsfoundonlyinartificialOphiocordycepssinensis圖14.篩選送檢8個蛋白Figure14.Eightproteinsscreened4.小結4.12-DE圖像分析本部分所用實驗材料為凍干冬蟲夏草，藥材在干燥加工過程中部分蛋白質可能會出現降解、變性，與新鮮藥材、幼嫩組織器官相比，蛋白質提取純化工作難度較大。本部分試驗在前期方法的基礎上，獲得了質量較高的2-DE圖譜。2-DE

圖譜分析結果顯示冬蟲夏草蛋白質較豐富，在分子量10kD-90kD的范圍內普遍分布，多樣性良好。人工冬蟲夏草各部分蛋白質斑點分布模式相似，顯示出蛋白質在生物體內表達的穩定性。同時圖像對比分析發現，子座部分雖然與人工冬蟲夏草整體及蟲體2-DE圖譜相似，具有相似的蛋白質成分表達，但蛋白質數量較少，提示在冬蟲

夏草菌侵染小金蝠蛾幼蟲的過程中，各種因素相互作用產生了大量新的蛋白質。4.2前期冬蟲夏草與混偽品差異斑點驗證前期課題組通過雙向電泳技術(2-DE)得到冬蟲夏草指標性蛋白質點26個，正品冬蟲夏草來源于四川（康定雅加梗、馬爾康縣梭磨鄉）、西藏那曲、青海西寧，混偽品為涼山蟲草、古尼蟲草、金針蟲蟲草、蛹蟲草及其它偽制品[29]。本課題在課題組前期的基礎上，對人工冬蟲夏草、人工冬蟲夏草菌蟲復合體、人工冬蟲夏草子座、小金蝠蛾幼蟲進行2-DE分析，建立蛋白質雙向電泳圖譜，使用PDQUEST對其進行圖像分析，驗證得到人工冬蟲夏草整體20個指標性蛋白質、人工冬蟲夏草菌蟲復合體18個指標性蛋白質、人工冬蟲夏草子座14個指標性蛋白質、小金蝠蛾幼蟲4個指標性蛋白質。5討論5.1小金蝠蛾幼蟲—人工冬蟲夏草差異蛋白分析圖譜顯示，小金蝠蛾幼蟲與人工冬蟲夏草的蛋白組有明顯差異，蛋白質分布和種類上全然不同，且小金蝠蛾幼蟲的蛋白質含量也遠高于人工冬蟲夏草，兩者之間的共有蛋白質極少，表明小金蝠蛾幼蟲與冬蟲夏草具有兩套不同的蛋白組，小金蝠蛾幼蟲被冬蟲夏草菌侵染后蛋白質發生了巨大的變化。5.2人工冬蟲夏草子座—人工冬蟲夏草差異蛋白分析圖像對比分析發現，人工冬蟲夏草子座與全體蛋白質斑點分布模式相似，具有相似的蛋白成分表達，蛋白質含量相差無幾，但蛋白質數量和種類上少于全體，部分蛋白質在冬蟲夏草的生長中穩定表達。提示小金蝠蛾幼蟲被冬蟲夏草菌侵染后有新的蛋白質形成。5.3基于蛋白質組分析冬蟲夏草的生長發育在冬蟲夏草的形成過程中，蛋白質含量及種類最高的是小金蝠蛾幼蟲，在小金蝠蛾幼蟲被冬蟲夏草菌侵染后蛋白質含量和種類均大幅度降低，表明這一階段有大量的蛋白質產生。菌蟲復合體與子座的蛋白質分布和表達相似，但子座的蛋白質含量和種類不及菌蟲復合體，子座的蛋白質含量和種類也少于完整的冬蟲夏草，表明冬蟲夏草形成過程中的新蛋白在這一階段產生。5.4差異性蛋白質篩選本部分研究通過2-DE分析技術，獲得了人工冬蟲夏草整體、菌蟲復合體、

子座及小金蝠蛾幼蟲的蛋白質表達圖譜。圖譜分析發現人工冬蟲夏草樣品及小金蝠蛾幼蟲的蛋白質組均顯示出良好的多樣性，蛋白質種類豐富，且菌蟲復合體、子座與人工冬蟲夏草整體蛋白質斑點分布模式相似，同時采用PDQUESTTMBasic軟件對人工冬蟲夏草各樣品2-DE圖譜進行匹配分析，篩選出冬蟲夏草發育過程

的三個階段穩定存在的蛋白斑點34個，成為冬蟲夏草整體后，對比前兩個階段新產生蛋白斑點14個，并對其中8個表達量大、穩定，斑點清晰的蛋白質點進行

LC-MS/MS鑒定。第三章冬蟲夏草發育階段差異蛋白的鑒定與分析質譜(massspectrometry,MS)技術具有靈敏度、準確度、自動化程度高的特點，能準確測量肽和蛋白質的相對分子質量、氨基酸序列及翻譯后修飾。質譜法分析蛋白質的原理是通過電離源將蛋白質分子轉化為離子，然后利用質譜分析儀的電場、磁場將具有特定質量與電荷比值(M/Z)的蛋白質離子分離開來，經過離子檢測器收集分離的離子，確定離子的M/Z值，分析鑒定未知蛋白質。在生物化學、細胞生物學等領域應用廣泛，大多與PAGE、2-DE等聯用分析蛋白質。張金蘭等[31]利用液相色譜-高分辨質譜(HPLC-HRMS)，建立了用于復雜生物基質中來自多個活性成分的代謝物全貌分析的質譜樹形相似過濾技術，并將其應用于淫羊藿代謝產物的分析，實現了來自5個淫羊藿黃酮苷的115個代謝物的同時結構確認。劉淑瑩等[32]利用LC-MS指紋圖譜技術，結合抗氧化活性評價及化學計量學方法，從近百種樣本中篩選出五味子的優良品種。他們還利用烏頭類生物堿的骨架結構特點，根據多級串聯質譜特征碎片，建立了烏頭類生物堿的HPLC/ESIMS/MSn

分析方法[33]，從烏頭類植物中鑒定出上百種生物堿類成分，其中近半數為首次發現。肖紅斌等[34]利用基于UPLC-QTOF-MS的血清代謝組學方法，研究了金貴腎氣丸及六味地黃丸對腎虛模型動物的治療效果，將差異及輪廓分析用于發現與腎虛模型相關的主要生物標記物，將PCA用于評價藥物及其代謝物的影響。課題組前期利用質譜技術分析了8個經2-DE分離得到的冬蟲夏草指標性蛋白質以及正偽品21個指標性蛋白質，本研究對3個冬蟲夏草生長發育階段新產生的差異性蛋白質，5個穩定存在的蛋白質進行質譜鑒定分析，搜索NCBI數據庫，得到差異性蛋白質分子量、等電點、生物功能等信息，為研究冬蟲夏草的生長發育提供依據。1儀器與材料1.1儀器IKA振蕩器低溫高速離心機：貝克曼X-22R型microTOF-QII：德國BrukerDaltonics布魯克·道爾頓1.2樣品前期雙向電泳篩選出的8個蛋白質斑點。1.3試劑DTT、IAM購自Promega公司，NH4HCO3購自成都科龍化工試劑廠，均為分析純。乙腈購自美國賽默飛世爾（中國）公司、色譜純。水為超純水，美國Millpore公司。1.4主要試劑配置脫色液：1.25mL100mmol/LNH4HCO3，2.5mL100%乙腈，1.25mL超純水，混勻，備用。還原劑：2mL100mmol/LNH4HCO3，10mMDTT，混勻，備用。烷基化試劑：1mL100mmol/LNH4HCO3，40.69mgIAA，3mL超純水，混勻，備用。2方法[35-53]2.1蛋白膠內酶解2.1.1膠內蛋白斑點回收用直徑20mm槍頭將SDS

凝膠中目標蛋白質點條帶切膠回收，置于1.5mL滅菌EP

管中，編號；將膠用超純水潤洗3次，每次振蕩1min，放置15min，以除去膠中的SDS等雜質，棄液體。即得蛋白質譜樣品。2.1.2膠內蛋白質譜前處理脫色加入1mL脫色劑，清洗10min，脫色至膠塊完全透明；將膠塊取出，用乙腈脫水直達膠塊變為白色，真空抽干乙腈；加入還原劑使膠粒完全吸收，56℃恒溫水浴1h后，冷卻至室溫。烷基化取出樣品，棄去多余液體，迅速加入55mM烷基化試劑(IAM)，室溫避光孵育45min。棄去多余液體，加入50%乙腈，靜置20min后棄去液體，加入25mMNH4HCO3，振蕩，靜置吸脹10min，棄液體，重復上述操作。脫水消化用50%乙腈將膠清洗2次，用50%乙腈脫水后再用100%乙腈脫水，每次5min，脫水至膠塊變為白色，真空抽干乙腈；將1ug?uL-1用25mMNH4HCO3稀釋15倍后，加入膠塊中，37℃水浴消化過夜。萃取在樣品加入0.1%的FA終止消化。12000r?min-1

超聲5min，吸取上清液至新的EP管中，余下膠塊加入萃取液，37℃恒溫放置30min，超聲，合并上清液。將樣品溶液冷凍干燥處理，為待測樣品。2.2質譜分析取10uL樣品上清液進行質譜儀分析。用Mascot

軟件進行數據庫檢索肽段信息，得質譜結果。3結果質譜圖及其匹配的氨基酸序列如下。將獲得的8種蛋白質N-端序列與NCBI蛋白質數據庫中進行比對。4小結4.1差異蛋白數據庫分析質譜圖及其匹配的氨基酸序列如下。將獲得8種蛋白質N-端序列與NCBI蛋白質數據庫中進行比對。8種蛋白均來自于全庫。表4.8個差異蛋白質按等電點范圍分類Table4.8differentialproteinsclassifiedbyisoelectricpointrange表5.8個差異蛋白按分子量范圍分類Table5.8DifferentialProteinsbyMolecularWeightRange表6.8個差異蛋白數據庫檢索結果Table6.8resultsofdifferentialproteindatabaseretrieval圖15-圖22.

斑點1-8得分最高的肽段質譜圖

Figure15-22.Peptidespectrawiththehighestscoreforspot1-84.2差異蛋白的生物功能分析4.2.1生物功能概述斑點1為肌動蛋白(actin)，是一類高度保守的蛋白質，存在于所有真核細胞中,

參與細胞分裂、運動、遷移、形態的維持、生長等多種重要生理活動。細胞中肌動蛋白常與其結合蛋白(actinbindingprotein,ABP)結合，以單體（globularactinmonomer，G-肌動蛋白）、寡聚體及聚合體（filamentactin,，F-肌動蛋白）形式存在，執行不同的生理功能，聚合和非聚合形式的肌動蛋白在細胞中處于一種動態平衡[54]。斑點2為甘露醇-1-磷酸5-脫氫酶(Mannitol-1-phosphate5-dehydrogenase)，其參與甘露醇代謝過程。甘露醇具有利尿、脫水、鎮咳、祛痰、平喘、提高血漿滲透壓、清除人體內強毒性的羥自由基等作用，并且對多種疾病有一定的療效。這與蟲草補肺益腎、止咳化痰、強身健體的功效相一致[55]，并且蟲草類的保健品一般以甘露醇的含量作為其中的質控指標[56]。斑點3為含β-內酰胺酶結構域蛋白(beta-lactamasedomain-containingprotein)。根據NCBI生物咨詢學，含β-內酰胺酶結構的蛋白質是一種冬蟲夏草特有的蛋

白[57]。斑點4為轉醛縮酶(Transaldolase)，其對于戊糖磷酸途徑(pentosephosphate

pathway,PPP)中代謝物的平衡非常重要。戊糖磷酸途徑(pentosephosphatepathway,PPP)是植物體中糖代謝的重要途徑，其主要生理功能是產生供還原性生物合成需要的NADPH以及可供核酸代謝的磷酸戊糖，一些中間產物則可參與氨基酸合成和脂肪酸合成等。已有研究表明,戊糖磷酸途徑與植物的生長發育和各種環境脅迫等密切相關[58]。斑點5屬于甘油醛/磷酸甘油脫氫酶家族(Glyceraldehyde/Erythrosephosphatedehydrogenasefamily)，其對甘油醛-3-磷酸脫氫酶(NAD+)（磷酸化）活性有重要的影響。甘油醛-3-磷酸脫氫酶是葉綠體卡爾文環中的一種重要的調節酶，它是卡爾文環中唯一利用由光系統I產生的還原能力(NADPH)催化光合作用的最初產物3-磷酸甘油酸(3-PGA)還原成3-磷酸甘油醛[59]。斑點6與斑點8均被鑒定為假設蛋白(hypotheticalprotein)。斑點7為GTP結合核蛋白(GTP-bindingnuclearprotein)，GTP結合蛋白廣泛存在于原核和真核生物中，參與細胞內一系列的信息傳遞過程，如：跨膜信使物質的信號傳遞，光信號的傳遞，蛋自質的生物合成，細胞骨架組織的形成等等，其共同特點是結合并利用GTP[60]。4.2.2GO注釋分析通過GO注釋比較發現，冬蟲夏草全體階段新產生的斑點1.5.6共同參與了

細胞(cell)、細胞區域(cellpart)、細胞組分(cellularcomponent)、細胞內(intracellular)、細胞內部分(intracellularpart)過程。此外，斑點1參與大量核苷酸結合和酶活性過程，如核苷酸結合(ribonucleotidebinding)、焦磷酸酶活性(pyrophosphataseactivity)、嘌呤核苷酸結合(purineribonucleotidebinding)、嘌呤核苷酸結合(purine

nucleotide

binding)

、核苷三磷酸酶活性

(nucleoside-triphosphataseactivity)、在含磷酸酐中作用于酸酐的水解酶活性(hydrolaseactivity,actingonacidanhydrides,inphosphorus-containinganhydrides)、作用于糖基鍵的水解酶活性(hydrolaseactivity,actingonglycosylbonds)、水解酶活性(hydrolaseactivity)、碳水化合物衍生結合(carbohydratederivativebinding)、ATP結合(ATPbinding)、腺嘌呤核苷酸結合(adenylribonucleotidebinding)、腺苷酸核苷酸結合(adenylnucleotidebinding)過程等；斑點5參與了大量代謝過程和化

合物結合過程，如小分子代謝過程(smallmoleculemetabolicprocess)、單生物體代謝過程(single-organismmetabolicprocess)、小分子結合(smallmoleculebinding)、有機環狀化合物結合(organiccycliccompoundbinding)、核苷結合(nucleoside

binding)、核苷磷酸結合(nucleosidephosphatebinding)、雜環化合物結合(heterocycliccompoundbinding)等；斑點6參與了大量代謝過程和細胞生長過程，如單生物體代謝過程(single-organismmetabolicprocess)、初級代謝過程(primary

metabolicprocess)、代謝過程(metabolicprocess)細胞器(organelle)、線粒體(mitochondrion)、膜部分(membrancepart)、膜(membrance)、膜的固有組成部分(intrinsiccomponentofmembrance)、細胞內細胞器(intracellularorganelle)、細胞內有膜的細胞器(intracellular

membrance-bounded

organelle)

、細胞骨架(cytoskeleton)、細胞骨架部分(cytoskeletonpart)等。冬蟲夏草生長過程穩定存在的斑點2.3共同參與了刺激過程(responsetostimulus)、核苷三磷酸酶結合(nucleoside-triphosphatasebinding)。此外，斑點2參與了大量的細胞器過程和結合過程，如：細胞器部分(organellepart)、核部分(nuclearpart)、細胞內的細胞器部分(intracellularorganellepart)、細胞骨架部分(cytoskeletonpart)、碳水化合物衍生結合(carbohydratederivativebinding)、ATP結合(ATPbinding)、陰離子結合(anionbinding)、腺嘌呤核苷酸結合(adenylribonucleotidebinding)、腺苷酸核苷酸結合(adenylnucleotidebinding)；斑點3參與了大量的細胞骨架過程和嘌呤核苷酸結合過程，如：細胞骨架(cytoskeleton)、細胞骨架部分(cytoskeletonpart)、胞質部分(cytoplasmicpart)、嘌呤核苷酸結合(purineribonucleotidebinding)、三磷酸嘌呤核苷酸結合(purineribonucleotidetriphosphatasebinding)、嘌呤核苷酸結合(purinenucleotidebinding)、核苷酸結合(nucleotidebinding)等。斑點4

大量參與了有機氮化合物代謝過程(organonitrogencompoundmetabolicprocess)、細胞組分(cellularcomponent)、金屬離子結合(metalionbonding)、陽離子結合(cationbonding)等。斑點7除參與細胞過程外還大量參與生物調節過程和水解酶活性過程，如：細胞過程的調節(regulationofcellularprocess)、生物過程的調節(regulationofbiologicalprocess)、生物調節(biologicalregulation)、焦磷酸酶活性(pyrophosphataseactivity)、在含磷酸酐中作用于酸酐的水解酶活性(hydrolaseactivity,actingonacidanhydrides,inphosphorus-containinganhydrides)、作用于酸酐的水解酶活性(hydrolaseactivity,actingonacidanhydrides)等。斑點8除參與細胞過程和膜過程外，大量參與了各種運輸過程和轉錄合成過

程，如：單價無機陽離子運輸(monovalentinorganiccationtransport)、離子運輸(ion

transport)、離子跨膜運輸(ion

transmembrane

transport)、氫運輸(hydrogen

transport)、氫離子跨膜運輸(hydrogeniontransmembranetransport)、陽離子跨膜運輸(cationtransmembranetransport)、質子傳輸雙段ATPase復合物，催化域(proton-transportingtwo-sectorATPasecomplex,catalyticdomain)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄(transcriptionfromRNApoiymerase

Ⅱpromoter)、核糖體生物合成(ribosomebiogenesis)、核糖核蛋白復合物的生物發生(ribonucleoproteincomplex

biogenesis)、質子傳輸雙段ATP酶復合物(proton-transportingtwo-sectorATPase

complex)、質子轉運ATP合成酶復合物(proton-transportingATPsynthasecomplex)、蛋白復合物(proteincomplex)、核(nucleus)、膜蛋白復合物(membraneproteincomplex)等。4.2.3KEGG通路富集分析最后對8個蛋白質進行了KEGG功能注釋的比較分析，進一步了解其在各個代謝通路活躍程度的差異。斑點1活躍的代謝途徑集中在磷脂酰肌醇信號系統(Phosphatidylinositolsignalingsystem)、吞噬小體(phagosome)；斑點2活躍的代謝途徑集中在金字塔代謝(pyramidmetabolism)；斑點3活躍的代謝途徑集中在內吞作用(endocytosis)、緊密連接(tightjunction)：斑點4活躍的代謝途徑集中在氮代謝(nitrogenmetabolism)、氨基酸的生物合成(biosynthesisofaminoacid)；斑點5活躍的代謝途徑集中在單環內酰胺生物合成(monobactambiosynthesis)、維生素B6代謝(vitaminB6metabolism)、硫代謝(sulfurmetabolism)；斑點6活躍的代謝途徑集中在維生素B6代謝(vitaminB6metabolism)；斑點7活躍的代謝途徑集中在葉酸生物合成(folatebiosynthesis)、藥物代謝—細胞色素P450(drugmetabolismcytochromeP450)、非核糖體肽結構(nonribosomalpeptidestructures)、HTLV-I感染(HTLV-Iinfection)、愛潑斯坦-

巴爾病毒感染(Epstein-Barrvirusinfection)；斑8活躍的代謝途徑集中在谷胱甘肽代謝(Glutathionemetabolism)、真核生物核糖體合成(Ribosomebiogenesisineukaryotes)。5討論對冬蟲夏草蛋白組的分析是試圖從蛋白質層面上研究冬蟲夏草的生長發育，另一方面也有利于從中找尋有價值的蛋白信息。我們通過SDS分離蛋白，然后切膠后進行LC-MS/MS質譜鑒定，利用Mascot軟件搜索冬蟲夏草已經公布的蛋白質數據庫，得到需要的蛋白質數據。經對比分析共鑒定3個冬蟲夏草發育階段新產生的差異性蛋白質，5個穩定存在的蛋白質。越來越多的蛋白質組研究開始用2-DE，使復雜蛋白質能夠分離的更開，本研究使用2-DE研究冬蟲夏草的蛋白質組，能比較直觀的看到數個比較樣本的蛋白數量、分布的變化。我們對鑒定出的8個蛋白質進行了GO、KEGG兩種功能注釋，并進行了較為系統的比較。5個穩定存在的蛋白質在核苷酸結合及代謝，轉錄調節，細胞內活動比較活躍；3個發育階段新產生的蛋白質在碳水化合物代謝，化合物結合、細胞骨架的生物合成等會相對活躍。這些結果與轉錄組得到的結論相符，也與真菌發育所需相一致，在子實體形成階段，細胞骨架的合成會相對活躍。斑點1鑒定為肌動蛋白，GO注釋發現該蛋白大量參與了細胞、細胞區域、細胞組分、細胞內、細胞內部分等過程，KEGG注釋發現其活躍的代謝途徑為磷脂酰肌醇信號系統、吞噬小體，提示肌動蛋白可能在冬蟲夏草的生長發育中其重要作用。這些結論與轉錄組得到的結論相符。本研究對冬蟲夏草生長階段蛋白組的分析僅處于比較初步的階段，要更深入分析，可以進行冬蟲夏草的全蛋白質組分析研究，更系統的了解冬蟲夏草各個生長階段蛋白質的表達情況。第四章野生冬蟲夏草、人工冬蟲夏草蛋白質組分析1975年，意大利生化學家O'Farell建立了經典的2-DE技術，并首次成功用于分離約1000個大腸桿菌、老鼠及幾尼豬的蛋白質斑點，但蛋白質譜不穩定，易隨環境而變化[61]。經過近40年的發展，伴隨著如固相pH

梯度凝膠電泳,

差異凝膠電泳,

質譜技術等的建立與完善，2-DE技術已日趨成熟，是目前唯一可以在一塊凝膠上同時分離上萬個蛋白質的方法，且分離純度可達90%以上。2007年，Wang

等[62]采用蛋白質組學技術從分子水平考察復方雙丹（丹參和丹皮）煎劑抗大鼠急性心肌梗死的作用機制，運用2-DE和MALDI-TOFMS結合技術分離和鑒定了23個差異蛋白，這些蛋白分別與能量代謝、氧化應激和細胞骨架有關，從而整體闡述了雙丹煎劑通過調節心肌能量代謝、抗氧化應激損傷等多途徑發揮抗心肌梗死的作用。Qi[63]等運用蛋白質組學研究桃紅四物湯對氧糖剝奪腦缺血再灌注損傷PC12細胞凋亡的保護機制，采用2-DE結合MALDI-TOFMS

分析了26個與桃紅四物湯調控作用相關的蛋白質，并鑒定這些蛋白參與多種重要的生化過程，具有不同的生理功能。本研究應用雙向電泳技術對野生冬蟲夏草整體、菌蟲復合體、子座及人工冬蟲夏草整體、菌蟲復合體、子座的蛋白質組進行分析，篩選出野生冬蟲夏草及人工冬蟲夏草差異性蛋白質，驗證前期冬蟲夏草指標性蛋白質并在蛋白質層面揭示了野生冬蟲夏草與人工培育冬蟲夏草的差異，為鑒別野生、人工冬蟲夏草提供資料。1儀器與材料1.1儀器低溫高速離心機：貝克曼X-22R型雙向電泳系統：Bio-Rad公司凝膠掃描成像系統：

Bio-Rad公司電熱恒溫鼓風干燥箱：上海島韓實業公司DHG-9035A型1.2試劑聚丙烯酰胺預混液、甘氨酸、BSA（純度≥99%）、Tris堿、CHAPS、碘乙酰胺、TEMED、SDS、尿素、過硫酸銨、覆蓋瓊脂糖、QuickStart?Bradford1x

DyeReagent、分離膠緩沖液、濃縮膠緩沖液、IPG膠條(17cm,pH3-10)、Bio-Lyte

(pH3-10)、DTT、PrecisionPlusProtein?

預染標準品、礦物油均購自Bio-Rad公司；PMS、APS、考馬斯亮藍R-250、低熔點瓊脂糖、溴酚藍、-巰基乙醇、Tween-80、購自鵬程生物科技有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、TCA、丙酮、甲醇、冰乙酸購自成都科龍化工試劑廠，均為分析純；水為去離子水。1.3主要試劑配置PBS緩沖液(0.02mol/L，pH=7.2)：5.16gNa2HPO4，0.87gNaH2PO4，超純水溶解定容至100mL。蛋白質提取液：PBS緩沖液(0.02mol/L，pH=7.2)，0.2%Tween80，0.2%β-巰基乙醇，1mMPMSF。10%TCA-丙酮：20gTCA，0.14gDTT，加丙酮溶解，定容至200mL，-20℃預冷。10%SDS：10gSDS，少量超純水加熱溶解，定容至100mL，混勻，室溫保存。10%APS：0.1gAPS，用時加入1mL超純水溶解，4℃保存。10×電泳緩沖液(10×=25mMTris,192mM

甘氨酸，0.1%SDS,pH8.3)：30gTris堿，144g甘氨酸，10gSDS，適量超純水溶解，定容至1000mL，混勻后室溫保存。膠條平衡緩沖液母液：72g尿素，4gSDS，適量超純水溶解，加入50mL

Tris-HCl(1.5MpH8.8Tris-HCl)，20mL甘油，定容至100mL。分裝，-20℃保存。水化上樣緩沖液：4.2g尿素，1.52g硫脲，0.4gCHAPS，0.098gDTT，適量超純水溶解，加入50L40%Bio-Lyte，10L溴酚藍(1%)，超純水定容至10mL。分裝，-20℃保存。