第7講:植物轉(zhuǎn)基因育種一、植物轉(zhuǎn)基因育種概述（一）植物轉(zhuǎn)基因育種概念

從供體生物中分離目的基因（或含目的基因的DNA片段）,經(jīng)DNA重組與遺傳轉(zhuǎn)化或直接轉(zhuǎn)入受體植物，經(jīng)過篩選獲得穩(wěn)定遺傳與表達(dá)的遺傳工程體，并經(jīng)田間選擇與試驗育成表現(xiàn)出目標(biāo)性狀的植物新品種或種質(zhì)資源的育種方式。

轉(zhuǎn)基因作物（GMcrops，GeneticallyModifiedcrops）

轉(zhuǎn)基因食品（GMfood，GeneticallyModifiedfood）（二）轉(zhuǎn)基因育種的優(yōu)勢可打破物種界限，拓寬可利用的基因資源；為培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗品種提供新的育種途徑；可定向改良受體品種的個別目標(biāo)性狀，但不改變其遺傳背景和既有性狀；大大提高選擇效率，加快育種進(jìn)程;可將植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物等生物制品。（三）轉(zhuǎn)基因育種的程序基因分離體外重組轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化體安全性評價結(jié)合常規(guī)育種轉(zhuǎn)基因品系市場開發(fā)載體的構(gòu)建農(nóng)桿菌介導(dǎo)，基因槍轟擊,等篩選遺傳穩(wěn)定性評價表達(dá)及表型鑒定轉(zhuǎn)基因品種區(qū)域試驗、品種審定（四）轉(zhuǎn)基因育種涉及的植物自1983年報道第一例轉(zhuǎn)基因煙草以來，至今已有200多種植物轉(zhuǎn)基因成功。已大面積推廣應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因作物主要包括：大豆(≈3/4)、棉花(≈4/5)

油菜(≈1/4)、玉米(≈1/3)（五）轉(zhuǎn)基因育種涉及的主要目標(biāo)性狀抗（耐）除草劑抗蟲抗（耐）病：細(xì)菌、真菌、病毒、線蟲等病害抗（耐）非生物脅迫：干旱、水澇、鹽堿、極端氣溫、瘠薄土壤提高品質(zhì)：蛋白、脂肪酸、淀粉、油脂、維生素等的組成及含量，耐儲藏性、休眠特性、花色，等提高產(chǎn)量：高光效、農(nóng)藝性狀、經(jīng)濟(jì)性狀雄性不育（六）全球轉(zhuǎn)基因植物育種進(jìn)展全球轉(zhuǎn)基因作物交易額：2005年達(dá)60億美元；2010年達(dá)200億美元。截止2010年，先后有59個國家通過了964項安全管理認(rèn)證，涉及的植物種類有24種；29個國家種植商品化轉(zhuǎn)基因植物；1540萬農(nóng)民種植轉(zhuǎn)基因作物。(七)我國轉(zhuǎn)基因植物育種進(jìn)展1992年中國首先在大田種植轉(zhuǎn)基因抗病毒煙草，揭開了全球轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化的序幕。至2012年，我國已研發(fā)獲得重要性狀基因300多個，其中46個具有自主知識產(chǎn)權(quán)。至2012年，我國已發(fā)放7種轉(zhuǎn)基因作物的安全證書：耐儲藏番茄、抗蟲棉、改變花色矮牽牛、抗病辣椒、抗病番木瓜、抗蟲水稻、轉(zhuǎn)植酸酶玉米（降解飼料中的植酸磷、釋放可被動物利用的無機(jī)磷、提高飼料利用效率，同時減少動物糞便中磷的排放）我國成為世界六大種植轉(zhuǎn)基因作物的國家之一，主要是轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。

2010年我國轉(zhuǎn)基因棉花種植面積為349萬公頃，占總種植面積七成以上。二、植物轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)及轉(zhuǎn)化方法（一）受體系統(tǒng)：指用于轉(zhuǎn)化的外植體通過組織培養(yǎng)途徑或其他非組織培養(yǎng)方法，產(chǎn)生高效穩(wěn)定繁殖的無性系，并能接受外源DNA整合、對抗生素等選擇敏感的再生體系。愈傷組織再生系統(tǒng)原生質(zhì)體再生系統(tǒng)生殖細(xì)胞受體系統(tǒng)胚狀體再生系統(tǒng)直接分化再生系統(tǒng)葉綠體再生系統(tǒng)

植物基因轉(zhuǎn)化的外植體建立植物轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的主要考慮因素：具有穩(wěn)定的外植體來源具有高效穩(wěn)定的再生能力具有較好的遺傳穩(wěn)定性對選擇性抗生素敏感對農(nóng)桿菌侵染敏感；低成本（二）轉(zhuǎn)化方法1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)法(Agrobacterium-mediatedtransformationmethod)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法程序載體制備感受態(tài)制備共培養(yǎng)洗滌農(nóng)桿菌分化成苗轉(zhuǎn)化子篩選工程菌制備煉苗移栽鑒定2.基因槍法：（genegun，microprojectilebombardment）利用火藥爆炸、高壓放電或高壓氣體作驅(qū)動力，將載有外源DNA的金粉（或鎢粉）等金屬微粒加速，射入受體細(xì)胞或組織，從而達(dá)到將外源DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的目的。發(fā)生士大夫受體細(xì)胞或組織的預(yù)處理DNA微彈的處理受體材料的轟擊過渡培養(yǎng)和篩選培養(yǎng)滲透壓調(diào)節(jié)甘露醇/山梨醇CaCl2、亞精氨、無水乙醇處理DNA+(金粉或鎢粉)3.花粉管通道法：(pollen-tubepathway)

利用植物受精過程中形成的花粉管通道將外源DNA導(dǎo)入植物的技術(shù)，為我國學(xué)者周光宇創(chuàng)立，1983年成功用此法將外源DNA導(dǎo)入棉花中。基本原理：授粉后外源DNA能沿著花粉管滲入，經(jīng)過珠心通道進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化尚不具備正常細(xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞。操作方法:（1）柱頭切除法；（2）花粉粒吸入法；（3）柱頭涂抹法4.聚乙二醇法：（polyethyleneglycol,PEG）

利用PEG使細(xì)胞膜之間或使DNA與膜形成分子橋，促使相互間接觸和粘連，并可通過改變細(xì)胞膜表面的電荷，引起細(xì)胞膜透性變化，從而促進(jìn)外源大分子進(jìn)入原生質(zhì)體，然后恢復(fù)膜透性，進(jìn)行培養(yǎng)分化。5.電擊法（electroporation）

又稱電穿孔法，利用高壓電脈沖作用使細(xì)胞膜上形成可逆性的瞬間通道，從而使外源DNA分子進(jìn)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法。6.顯微注射法（Microinjection）

利用顯微注射儀將外源DNA直接注入受體細(xì)胞（如原生質(zhì)體），并使其成活、增殖而發(fā)育成為轉(zhuǎn)基因個體。7.浸漬法：將葉片、胚、胚珠、子房、花粉粒、幼穗、懸浮細(xì)胞甚至幼苗等直接浸泡在外源DNA溶液中，利用滲透作用把外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞并得到整合與表達(dá)的一種轉(zhuǎn)化方式。基本原理：利用植物細(xì)胞自身的物質(zhì)運轉(zhuǎn)系統(tǒng)，將外源DNA直接導(dǎo)入受體細(xì)胞。外源DNA分子進(jìn)入細(xì)胞的途徑：①細(xì)胞間隙和胞間連絲途徑；②細(xì)胞的內(nèi)吞作用；③細(xì)胞膜的透性常用植物基因轉(zhuǎn)化方法比較評價項目植物基因轉(zhuǎn)化的方法農(nóng)桿菌法PEG法電擊法微針注射法基因槍法花粉管通道法受體材料完整細(xì)胞原生質(zhì)體原生質(zhì)體原生質(zhì)體完整細(xì)胞卵細(xì)胞宿主范圍有無無無無有性繁殖植物組培條件簡單復(fù)雜復(fù)雜復(fù)雜簡單無轉(zhuǎn)化率較高較低較低較高較高較低嵌合體比例有無無無多無操作復(fù)雜性簡單簡單復(fù)雜復(fù)雜復(fù)雜簡單設(shè)備要求便宜便宜昂貴昂貴昂貴便宜轉(zhuǎn)化工效高低低低高低單子葉植物應(yīng)用少可行可行可行廣泛廣泛三、外源基因的表達(dá)、檢測與遺傳特性

轉(zhuǎn)基因植物外源基因的表達(dá)及其調(diào)控外源基因的檢測轉(zhuǎn)基因植物的遺傳特性（一）轉(zhuǎn)基因植物外源基因的表達(dá)及其調(diào)控轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象：外源目的基因在轉(zhuǎn)化植株內(nèi)存在，但其表達(dá)水平很低，甚至不表達(dá)的現(xiàn)象。按其發(fā)生的階段可分為轉(zhuǎn)錄沉默和轉(zhuǎn)錄后沉默。轉(zhuǎn)基因沉默機(jī)理包括DNA甲基化、多拷貝整合、位置效應(yīng)、后成修飾作用等。提高外源基因表達(dá)水平的策略

強(qiáng)啟動子的選擇和改造；利用增強(qiáng)子序列；利用真核基因的調(diào)控序列；利用定位信號提高外源基因表達(dá)產(chǎn)物的含量；葉綠體轉(zhuǎn)化（基因拷貝數(shù)多）

（二）外源基因的檢測

轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)符合的條件及證據(jù)：①要有嚴(yán)格的對照（陽性、陰性）；②轉(zhuǎn)化當(dāng)代要提供外源基因整合和表達(dá)的分子生物學(xué)證據(jù)，物理數(shù)據(jù)（PCR，Southern雜交，Northern雜交，Western雜交等）與表型數(shù)據(jù)（酶活性分析等）；③提供外源基因控制的表型性狀證據(jù)（抗蟲、抗病等）；④根據(jù)該植物的繁殖方式（有性或無性）提供遺傳證據(jù)：有性繁殖植物需要目的基因控制的表型性狀傳遞給后代的證據(jù)；無性繁殖植物要有在繁殖后代中穩(wěn)定遺傳的證據(jù)。

報告基因的表達(dá)檢測：

1、Gus基因（β-葡萄糖苷酸酶基因）

2、NPT-Ⅱ基因（新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因）

3、GFP/RFP基因（綠色/紅色熒光蛋白基因）

4、冠癭堿合成酶基因（胭脂堿、章魚堿）

5、cat基因（氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因）

6、pat基因（抗除草劑基因）

7、潮霉素抗性基因外源目的基因的檢測外源基因的整合的Sourthern檢測外源基因的轉(zhuǎn)錄的Northern檢測外源基因表達(dá)蛋白的酶聯(lián)免疫吸附法（

ELISA)和WesternBlotting檢測外源基因整合和表達(dá)的原位雜交檢測轉(zhuǎn)基因植物的PCR檢測外源基因整合和表達(dá)的其他分析方法

RFLP,RAPD,整合位點遺傳分析,生物芯片分析（三）轉(zhuǎn)基因植物的遺傳特性外源基因的整合特性

整合位點隨機(jī)性；

整合拷貝數(shù)：單拷貝單位點插入，串聯(lián)拷貝單位點插入，多拷貝多位點插入；

外源基因整合的遺傳效應(yīng)

位置效應(yīng)：整合位點不同，表達(dá)效率也不同；

重組效應(yīng)：正效應(yīng)、負(fù)效應(yīng)和無影響的狀態(tài)；外源基因的遺傳特性

T1代為雜合等位基因，T2代開始分離與純合孟德爾式遺傳：單位點插入符合單基因分離規(guī)律；多位點插入符合獨立分離規(guī)律；

非孟德爾式遺傳：轉(zhuǎn)基因丟失；轉(zhuǎn)基因沉默；花粉致死；誘發(fā)隱性致死突變或轉(zhuǎn)基因純合致死四、轉(zhuǎn)基因生物安全性評價與管理

轉(zhuǎn)基因生物的安全性問題至今仍在全球范圍內(nèi)存在激烈的爭論。反對者認(rèn)為轉(zhuǎn)基因生物具有極大的潛在危險，可能會對人類健康和生態(tài)環(huán)境造成威脅。在歐洲，轉(zhuǎn)基因作物被一些媒體稱之為“惡魔食品”。（一）國際上幾個關(guān)于轉(zhuǎn)基因作物及食品安全性的爭議事件：Pusztai事件：英國Rowett研究所有位Pusztai博士，他用轉(zhuǎn)雪花蓮凝集素基因的土豆喂大鼠，1998年秋天在英國電視臺發(fā)表講話，聲稱大鼠食用了這種土豆后，體重和器官重量減輕，免疫系統(tǒng)受到了破壞。后果：綠色和平組織、地球之友等反生物技術(shù)組織把這種土豆說成“殺手”，并策劃了破壞轉(zhuǎn)基因作物試驗地等行動，焚燒了印度的兩塊試驗田，甚至美國加州大學(xué)戴維斯分校的非轉(zhuǎn)基因試驗材料也遭破壞，以致研究生畢業(yè)論文都無法如期完成。英國皇家學(xué)會組織了同行評審，并于1999年５月發(fā)表評論，指出Pusztai的試驗有六方面的錯誤：不能確定轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的化學(xué)成分有差異；對食用轉(zhuǎn)基因土豆的大鼠，未補(bǔ)充蛋白質(zhì)以防止饑餓；供試動物數(shù)量少，飼喂幾種不同的食物，且都不是大鼠的標(biāo)準(zhǔn)食物，缺少統(tǒng)計學(xué)意義；試驗設(shè)計差；統(tǒng)計方法不當(dāng)；試驗結(jié)果無一致性等。君主斑蝶事件：

1999年5月，康奈爾大學(xué)的一個研究組在《Nature》雜志上發(fā)表文章，聲稱轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的花粉飄到一種名叫“馬利筋”的雜草上，用馬利筋葉片飼喂美國大斑蝶，導(dǎo)致44％的幼蟲死亡。但是2000年開始在美國三個州和加拿大進(jìn)行的田間試驗都證明，抗蟲玉米花粉對斑蝶并不構(gòu)成威脅，實驗室試驗中用１０倍于田間的花粉量來喂大斑蝶的幼蟲，也沒有發(fā)現(xiàn)對其生長發(fā)育有影響。

斑蝶減少的真正原因，一是農(nóng)藥的過度使用，二是墨西哥生態(tài)環(huán)境的破壞。

加拿大“超級雜草”事件

由于基因漂流，在加拿大油菜地里發(fā)現(xiàn)了個別油菜植株可以抗一種、兩種或三種除草劑，因而有人稱此為“超級雜草”，并怪罪于轉(zhuǎn)基因。

基因漂流并不是從轉(zhuǎn)基因作物開始。如果沒有基因漂流，就不會有進(jìn)化，世界上也就不會有這么多種的植物和現(xiàn)在的作物栽培品種。中國抗蟲棉破壞環(huán)境事件：

2002年6月3日，南京環(huán)科所與綠色和平組織在北京召開會議，６月４日《Chinadaily》上發(fā)表了題為“GMCottonDamageEnviroment”的文章。當(dāng)天,綠色和平組織在其網(wǎng)站上刊登了長達(dá)26頁的英文報告，從而再次引發(fā)國際爭論，在歐、美產(chǎn)生巨大反響。６月５日德國《農(nóng)業(yè)報》發(fā)表了題為“中國研究Ｂｔ棉破壞環(huán)境巨大”。綠色和平組織的“中國項目主管”聲稱：“棉農(nóng)將面對不受控制的超級害蟲”、“轉(zhuǎn)基因抗蟲棉不但沒有解決問題，反而制造了更多的問題”、“棉農(nóng)將被迫使用更多、更毒的農(nóng)藥”。

事實上，抗蟲棉在中國實踐多年，深受廣大棉農(nóng)的歡迎。中國、美國、德國、加拿大、比利時、印度等國的科學(xué)家已在網(wǎng)上紛紛發(fā)表評論，反駁綠色和平組織的觀點。

湖北非法銷售轉(zhuǎn)基因水稻種子事件

2005年綠色和平組織在湖北發(fā)現(xiàn)非法銷售和種植的轉(zhuǎn)基因水稻“Bt汕優(yōu)63”種子，由此生產(chǎn)的大米已進(jìn)入市場，擔(dān)心威脅到消費者的健康和生態(tài)環(huán)境。

事實上，至今沒有任何證據(jù)或相關(guān)報道證明轉(zhuǎn)基因大米有害。爭論的背后實質(zhì)

：

現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因作物的安全性已經(jīng)成了國際貿(mào)易的技術(shù)壁壘。由于某些媒體的炒作，對消費者的心理和轉(zhuǎn)基因作物的產(chǎn)業(yè)化已經(jīng)產(chǎn)生了很大的負(fù)面影響。

我們的判斷？

（二）轉(zhuǎn)基因植物的安全性評價（風(fēng)險評估）1.轉(zhuǎn)基因植物食品的安全性評價（1）評價內(nèi)容

毒性：必須確保轉(zhuǎn)入的外源基因及其產(chǎn)品對人畜無毒。

過敏源：如果有過敏源形成基因轉(zhuǎn)入植物中，可能會對過敏人群造成不利的影響。

抗生素抗性標(biāo)記基因：目前尚無足夠證據(jù)表明此類基因安全或不安全，因此提倡無標(biāo)記（marker-free）轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。（2）評價原則

實質(zhì)等同原則：轉(zhuǎn)基因食品是否與市場上銷售的對于食品具有實質(zhì)等同性（成分、含量等）

預(yù)先防范性原則：轉(zhuǎn)基因植物