基因工程的基本操作程序1PPT課件1、基因工程包括哪些步驟？3、基因工程中的核心環節是哪一步？4、基因表達載體導入到受體細胞有哪些方法？5、目的基因導入受體細胞就會成功表達嗎？如何檢測和鑒定？2、什么是目的基因？獲取的方法有哪些方法？思考討論問題：2PPT課件3PPT課件基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取二、基因表達載體的構建三、將目的基因導入受體細胞四、目的基因的檢測與鑒定4PPT課件

主要是指編碼蛋白質的基因(一）目的基因

目前被廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、植物抗病基因（抗病毒、抗細菌)、人胰島素基因等。一、目的基因的獲取5PPT課件（二）獲取目的基因的方法1、從基因文庫中直接獲取2、PCR技術擴增3、化學方法直接人工合成6PPT課件1、從基因文庫中直接獲取（1）基因文庫的概念部分基因文庫：

基因組DNA文庫：

將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫含有一種生物的全部基因只包含了一種生物的部分基因，如:cDNA文庫7PPT課件（2）基因文庫的建立方法提取某種生物的全部DNA用適當的限制酶酶切一定大小的DNA片段將DNA片段與運載體連接導入受體菌中儲存基因組文庫方法一：直接分離法8PPT課件某種生物的單鏈mRNA單鏈互補DNA雙鏈cDNA片段導入受體菌中儲存與運載體連接cDNA文庫反（逆）轉錄酶DNA聚合酶方法二：反轉錄法--cDNA的合成流程圖解9PPT課件PCR技術—多聚酶鏈式反應PCR擴增儀DNA半保留復制的基本原理一段已知目的基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對引物熱穩定DNA聚合酶(Taq酶）模板DNA2、利用PCR技術擴增目的基因原理：前提：條件：10PPT課件利用PCR技術擴增目的基因11PPT課件5’3’G—GT—C3’5’A—GC—C5’3’引物ⅡG—G高溫變性低溫退火中溫延伸1.目的基因DNA受熱變性，解鏈；5’3’A—G

引物Ⅰ2.引物與單鏈互補結合；3.合成鏈在DNA聚合酶作用下進行延伸。12PPT課件蛋白質的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結構基因的核苷酸序列目的基因推測推測化學合成3、人工合成13PPT課件——

核心二、基因表達載體的構建功能：使目的基因進入受體細胞并有效表達，而且要能穩定存在且遺傳給后代。14PPT課件基因表達載體的構建1）用一定的限制酶切割質粒，使其出現一個切口，露出黏性末端。

2）用同一種限制酶切斷目的基因，使其產生相同的黏性末端。

3）將切下的目的基因片段插入質粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個重組DNA分子（重組質粒）

目的基因與運載體的結合過程，實際上是不同來源的基因重組的過程。15PPT課件編碼區非編碼區非編碼區啟動子

啟動子：位于基因首端一段能與RNA聚合酶結合并能起始mRNA合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉錄。RNA聚合酶:能夠識別啟動子上的結合位點并與其結合的一種蛋白質.

終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉錄終止。終止子16PPT課件編碼區非編碼區非編碼區啟動子終止子AGGTCACGTCGTCCAGTGCAGCRNA聚合酶AGGUCACGUCG17PPT課件基因表達載體的組成：b、目的基因a、啟動子c、終止子d、標記基因e、復制原點18PPT課件1、下列屬于獲取目的基因的方法的是①利用mRNA反轉錄形成②從基因組文庫中提取③從受體細胞中提取④利用PCR技術⑤利用DNA轉錄 ⑥人工合成

A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥小試牛刀19PPT課件2、1997年，科學家將動物體內的能夠合成胰島素的基因與大腸桿菌的DNA分子重組，并且在大腸桿菌中表達成功。請據右下圖回答問題。(1)此圖表示的是采取__________合成基因的方法獲取__________基因的過程。(2)圖中①DNA是以為__________________模板，形成單鏈DNA，在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得了所需要的目的基因。人工目的

控制胰島素合成的信使RNA

小試牛刀20PPT課件(3)圖中③代表

，它往往含

基因，以便對目的基因的檢測。重組DNA分子

標記

21PPT課件常用的受體細胞：

有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農桿菌、酵母菌和動植物細胞等。將目的基因導入受體細胞的原理借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。三、目的基因導入受體細胞22PPT課件將目的基因導入植物細胞的方法1、農桿菌轉化法2、基因槍法3、花粉管通道法23PPT課件土壤農桿菌轉化法示意圖24PPT課件將目的基因導入動物細胞的方法顯微注射法25PPT課件將目的基因導入微生物細胞方法宿主細胞（大腸桿菌）感受態細胞（大腸桿菌）Ca2+26PPT課件四、目的基因的檢測與鑒定首先：其次：最后：還要：要檢測轉基因生物的DNA上是否插入目的基因DNA分子雜交技術分子探針檢測目的基因是否轉錄出mRNA檢測目的基因是否翻譯出蛋白質個體生物學水平的鑒定27PPT課件

不能，受體細胞必須表現出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達。

受體細胞攝入DNA分子后就說明目的基因完成了表達嗎？若不能表達，要對抗蟲基因再進行修飾。28PPT課件多細胞生物的檢測，將每個受體細胞單獨培養并誘導發育成完整個體，檢測這些個體是否攝入目的基因，攝入的基因是否表達（是否表現出相應的性狀）。淘汰無變化的個體，保留有相應變化的個體進一步培養、研究。例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達。29PPT課件3．（2010江蘇高考，27題，8分）下表中列出了幾種限制酶識別序列及其切割位點，圖l、圖2中箭頭表示相關限制酶的酶切位點。請回答下列問題：（1）一個圖1所示的質粒分子經SmaⅠ切割前后，分別含有

個游離的磷酸基團。0、2

30PPT課件（2）若對圖中質粒進行改造，插入的SmaⅠ酶切位點越多，質粒的熱穩定性越

。（3）用圖中的質粒和外源DNA構建重組質粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是

。（4）與只使用EcoRI相比較，使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時處理質粒、外源DNA的優點在于可以防止

。（5）為了獲取重組質粒，將切割后的質粒與目的基因片段混合，并加入

酶。（6）重組質粒中抗生素抗性基因的作用是為了

。（7）為了從cDNA文庫中分離獲取蔗糖轉運蛋白基因，將重組質粒導入喪失吸收蔗糖能力的大