細胞培育試驗寫報告內容細胞培育試驗寫報告內容細胞培育試驗寫報告內容1目的目的2原理原理3材料與方法（操作步驟）材料與方法（操作步驟）4試驗結果試驗結果5結論或結果分析結論或結果分析試驗一雞胚原代成纖維細胞的制備與培育雞胚原代成纖維細胞的制備與培育 試驗二濾泡性□炎病毒（VSV）的增殖（純培育）試驗二濾泡性口炎病毒（VSV）的增殖（純培育）試驗三Hep-2細胞的傳代培育試驗三Hep-2細胞的傳代培育試驗四VSVTCID試驗四VSVTCID5050滴定滴定試驗五干擾素活性（效價）的測定試驗五干擾素活性（效價）的測定試驗六VSV中和試驗（稀釋血清固定病毒法） 試驗六VSV中和試驗（稀釋血清固定病毒法） 試驗二雞胚原代成纖維細胞的制備與培育試驗二雞胚原代成纖維細胞的制備與培育一、目的一、目的1、駕馭雞胚原代成纖維細胞的制備及培育的基本步驟；2、駕馭活細胞的顯微鏡下視察；3熟識病毒在細胞內增殖的基本推斷方法。二、原理二、原理離體動物組織通過溫柔的手段（機械和酶消化）形成單個細胞后，在相宜的外界環境中，包括溫度、酸堿度和氣相環境，并賜予足夠合適的養分條件，能生存、生長形成單層細胞，這種原代培育的細胞具有原來體內所具備的基本特性，比如肌肉細胞的收縮功能；上皮細胞的分泌功能等。通常把這種從體內取出組織細胞起先培育到第一次進行傳代之前的這一段時期稱為原（初）代培育。洪源)人民衛生出版社2007)1)Reed-Muench法計算CCID50舉例如下：六、寫試驗報告并計算給定的病毒的。VSV在Hep-2細胞上的TCID50結果記錄病毒稀釋度病變孔數/接種孔數累積數(孔)病變細胞孔有病變無病變比例百分比(%) 10-34/4909/910010-43/4515/68310-52/4232/54010-60/4070/70由上表可知該病毒的CCID50介于10-4與10-5兩個稀釋度之間，二稀釋度之間的距離比例為：高于 50%感染百分數-50%83-50距離比例二一 1g稀釋倍數二 二-0.767 高于50%的感染百分數-低于50%的感染百分數 83-40低稀釋度的對數(高于50%的感染百分數)=310-4二-4坨0m)50二高于50%的感染百分數的低稀釋度的對數+距離比例 =(-4)+(-0.767)=—4.767-4.8因此該病毒的CCID50為10-4.8/0.1ml,也就是說，此病毒的10-4.8的濃度(即1：63000)按0.1ml接種一組細胞孔后，可使50%的細胞感染,即有50%病變的可能性。2)Karber法計算二、試驗結果的視察(《病毒學檢驗》P55)1、視察結果 于培育后的不同時間，如18h、24h、36h等，在倒置顯做鏡下視察細胞病變狀況。a)細胞病變程度表示法通觀整個單層區，權衡總的狀況，以下列符號表示其病變程度:-表示無細胞病變+表示1%?25%的細胞病變++26%?50%的細胞有病變+++51%?75%的細胞有病變++++76%?100%的細胞有病變b）記錄結果病毒引起細胞病變效應的滴度以半數細胞培育感染量（cellcultureinfectiousdose,CCID50）表示，即凡能使50%（半數）細胞出現病變的最高病毒稀釋度，即為50%感染單位，簡稱CCID50o有時也稱其為半數組織培育感染量（50%tissuecultureinfectiousdose,TCID50）。細胞病變效應出現的時間，不同病毒不完全一樣，以感染細胞的病變不再發展，而比照細胞仍舊完好為準。試驗六干擾素活性（效價）的測定試驗六干擾素活性（效價）的測定（注：此試驗所需的細胞為試驗四時傳代培育所得）一、目的一、目的1、駕馭微量細胞病變抑制法測定干擾素效價的基本步驟以及結果分析。2、熟識常用生物制品生物學活性測定的實際意義。3、了解影響結果的常見因素。二、基本原理二、基本原理病毒或其他干擾素誘生劑作用于巨噬細胞、T細胞或成纖維細胞后，由細胞基因自身編碼產生的具有抗病毒、抗腫瘤和調整免疫功能的一類小分子糖肽，統稱為干擾素。干擾素發揮重要的酶的特性而抑制病毒DNA和蛋白質的合成，從而抑制病毒在細胞內的增殖。因此具有間接的廣譜抗病毒作用。為了進一步確定人工方法制備的干擾素的生物學活性，需進行體外抗病毒試驗測定，即干擾素效價的測定。干擾素效價一般定義為：凡1ml干擾素標本的最高稀釋度仍能愛護半數細胞(50%)免受攻擊病毒損害者，該稀釋度的倒數即為干擾素的效價，即單位/毫升。三、測定方法三、測定方法測定干擾素效價的方法有多種,最常用的是細胞病變抑制法(MethodofCytopathiceffectinhibitionassay,簡稱CPE法)。此法的主要優點是操作簡便，易于駕馭，結果牢靠，故已成為目前各試驗室的常規。亦可用放射化學測定法、染料攝入測定法。本次試驗也主要采納前法。下面就此法的發展做一簡要闡述。1、全量細胞病變抑制測定法優點：操作簡潔、易于駕馭、結果牢靠缺點：大量測定時，耗費細胞量太大，清洗工作量大，推斷結果不能完全排出主觀因素。2、常規微量細胞病變抑制測定法此法是在全量法基礎上加以改良的一種方法，它的最大優點是:需用細胞量少，適于大量干擾素標本檢測。其主要缺點是：推斷結果不能完全解除主觀因素。詳細操作形式有：先使細胞培育24?48h形成單層后，再加入不同稀釋度的干擾素孵育24h,棄去，再加入100TCID50的攻擊病毒，接著孵育直至病毒比照出現完全病變為止。主要特點是干擾素稀釋標本和細胞同時加，優點是細胞對攻擊病毒較敏感，且省時。兩種方法滴定的干擾素效價無明顯差別。3、微量快速檢測法（一步快速法）本法的特點是干擾素（不同稀釋倍數）、細胞（肯定濃度）和病毒（肯定量）三者同時加入。因為干擾素誘導細胞形成抗病毒狀態要先于病毒的復制與成熟，即VSV的復制周期為7小時，而干擾素作用于靶細胞后約1小時即形成抗病毒狀態。但一步快速法的敏感性隨病毒攻擊劑量的提高而快速下降。因此常規微量法比微量快速法穩定。四、材料打算四、材料打算1、待測標本為了除去非干擾素抑制物，待測標本應作（1）離心處理；（2）pH處理（此步學生不需做）。可分裝為20?401/份/2人。2、測定細胞應依據種屬特異性選擇測定細胞。本試驗室選用生長良好的一日齡或兩日齡人羊膜單層細胞傳代培育物（WISH）或人喉癌上皮細胞（Hep-2）,本次試驗選取后者。3＞攻擊病毒選用具有同步致病作用的VSV（VesicularStomatitisVirus）作為攻擊病毒。運用前，應先在原代雞胚成纖維細胞培育物（約400萬細胞/毫升）中傳代增殖及滴定病毒的空斑形成單位（PFU）或在人羊膜單層細胞上滴定其TCID50o病毒的攻擊量一般可選10CT300個TCID50（一般不得小于10個TCID50,不得大于500個TCID50）。4、胰蛋白酶混合消化液VTP,其胰蛋白酶和Versene的最終濃度分別為0.05和0.02。用VTP比單用胰蛋白酶作消化液對細胞的損傷要小些。5、養分培育基配方是（1）DMEM；（2）10%滅活小牛血清；（3）雙抗。最終用NaHC03調pH至7.2~7.4。6、微量細胞培育板無菌40孔進口板1塊/組。7、C02培育裝置采納C02孵箱（C02為5%,空氣為95%）。8、其他器材：5ml吸管2只/組，1ml吸管1只/組，tip頭1盒/桌。五、操作步驟五、操作步驟1、稀釋待檢干擾素（在微量滴定板上干脆進行）（1）配制10%小牛血清的養分液5mL除第一列外，在第一、二排的第2-10孔各加1001養分液；（2）將待檢干擾素進行400倍稀釋后，分別取100L于第一孔和其次孔，將其次孔，充分吹吸3次，吸出1001于第三孔，重復上述操作，直到第8孔，吹吸后棄去1001。因此依據倍倍稀釋原則對干擾素進行系列稀釋，各孔的稀釋倍數如下表所列。第九孔為細胞比照孔，不加干擾素愛護也不加病毒攻擊；第十孔為病毒比照，不加干擾素愛護加病毒攻擊。其次排依據同樣方法進行，即每個稀釋度重復兩孔。每孔含量為1001。2、微量單層細胞培育（1）按常規方法將預先培育好的細胞單層用VTP消化下來；（2）用養分培育基將細胞制成40萬個細胞/毫升的懸液；（3）用加樣器向微量細胞培育板每孔中加入100L細胞懸液（加時不斷搖勻瓶中的細胞）；（4）置C02孵箱中培育18?24h。3、病毒攻擊視察到細胞單層良好時，將各孔內含干擾的培育液倒掉，于每孔中加入100TCID50的攻擊病毒VSV1001,該病毒用3%維持液稀釋，細胞比照組加入等量的維持液。本組加入24小時引起75?100病變的VSVlOOlo置37℃孵育24?40小時。4、視察結果管號123456789（細胞比照孔）10（病毒比照）養分液（L） 100100100100100100100100100干擾素（L）200上孔100一的上一孔的100上一孔的10013200上一孔的10016400上一孔的100112800上一孔的100125600±一孔的100,棄去100 干擾素稀釋倍數細胞1：4001：8001：1600：1：51200每孔均為10014.1可干脆倒置顯微鏡視察。在規定的時間內首先視察細胞比照組和病毒比照組，若病毒比照組各孔中的細胞出現75100%的明顯病變和死亡，而細胞比照組中的細胞仍完全生長良好，則表明比照系統完全合格，即可作全面視察。否則棄去重做。每孔中出現的細胞病變（CPE）程度，用+表示。一般病毒比照孔，出現+++或++++,干擾素愛護孔CPE不再進展,則可終止反應，并染色。4.2結晶紫染色：將上述反應板取出，棄去孔內液體于消毒液中，每孔加入1滴染色液，3?5min后，棄去，洗凈孔內殘余液體，控干即可記錄結果。細胞著色的深淺可以直觀反應CPE出現的程度，一般++++時板孔內幾乎無可見的細胞貼壁層，無CPE時則板孔內細胞貼壁層完整。六、結果推斷與計算分析六、結果推斷與計算分析1、效價單位：效價以單位/毫升表示一般判定法：凡1ml干擾素標本的最高稀釋度仍能愛護半數細胞（50%）免受攻擊病毒損害者，該稀釋度的倒數即為干擾素的單位/毫升。如某干擾素稀釋到1：8000時仍能愛護半數細胞（50%）免受攻擊病毒的損害，即出現++的稀釋度，則該干擾素的效價即為8000單位/毫升。特別計算法（通常依據Reed-Muench法計算）O1計算愛護百分比，見下表A、B、C項為原始數據，4+表示全部細胞病變；3+表示75%細胞病變；2+表示50%細胞病變；1+表示25%細胞病變。02求出干擾素單位從上表中可大略看出，此批干擾素能愛護半數（50%）細胞不被攻擊病毒A項B項C項D項E項F項G項干擾素稀釋度病變細胞正常細胞平均數累積比例百分比（%）管1管2管1管2病變正常病變（）0013581216正常（）正常/（正常+病變）16/1612/128/95/83/81/9001：400（21：800（21：1600(21：3200(21：6400(2-6101：12800(21：25600(21：51200(2-210-310-410-5 10-2)-2)-2)-2)-2)-2)-2)-2)-710-810-9100012234444322100161285310010010089633800損害的最高稀釋度在1：3200-1：6400之間。因此，可通過下式求出其距離比。高于50%的百分比一50 63一50距離比= ==0.52 高于50%的百分比一低于50%的百分比63-38即此批干擾素稀釋到2—5.52 10-2(1:4588)時，能愛護半數細胞免受攻擊病毒損害，其結果可記為5.52Log2+2單位/毫升(5.52Log2+2u.ml—1)。4、工作單位修正各試驗室所測得的干擾素單位，習慣上一般都稱為該試驗室工作單位。為了表明某種干擾素效價的凹凸，就必需用同型國際干擾素參考制劑加以修正。例如，當我們要修正本試驗室所制備的獸用白細胞干擾素的效價時，就應當：(1)查明獸用白細胞干擾素參考制劑的標準單位(R1)(2)并在相同條件下測出獸用白細胞干擾素參考制劑的工作單位(R2)(3)測出本試驗室所制獸用白細胞干擾素的工作單位(X2)(4)按下式求出本室所制獸用白細胞干擾素的修正單位(XI)：R1:XI=R2:X2例如設：Rl=5000單位，R2=10000單位，X2=8000單位；則按上式可求知：XI=4000單位。試驗七VSV中和試驗(稀釋血清固定病毒法)試驗七VSV中和試驗(稀釋血清固定病毒法)一、試驗目的一、試驗目的測定血清中的VSV中和抗體效價二、試驗原理二、試驗原理特異的抗病毒免疫血清(中和抗體)和病毒作用后，使病毒失去感染的實力，一種病毒只能被相應的免疫血清所中和，中和肯定量的病毒的感染力必需有肯定效價的中和抗體。依據稀釋成分不同可分為兩種方法。一為固定病毒用量(100TCID50)與等量一系列倍比稀釋的血清進行中和試驗，以血清中和抗體滴度表示。二為固定血清用量與等量一系列對數稀釋的病毒進行中和試驗。結果以中和指數表示。三、試驗材料三、試驗材料VSV免疫動物血清(S1、S3)、原代細胞最接近體內細胞的特性，因而對外界環境的變更也最敏感，因此比較適合病毒的增殖，藥物的作用機制等的探討。三、材料三、材料（按2人/組的量發放）名稱數量備注9-11日齡雞胚無菌器械無菌無毒平皿5或10ml吸管1或5ml吸管青霉素瓶（帶塞）Hanks液1640RMPI或DMEM雙抗胰蛋白酶小牛血清5.6%NaHC03碘酒和酒精棉球細胞培育瓶1只1套2只4支1支2只250ml500ml5ml1ml5ml3ml若干2只 四、操作步驟四、操作步驟1、在DMEM和Hanks液中分別無菌操作以1%的量加入雙抗，吸出10-15mlHanks液至無菌平皿中備用；2、碘酒和酒精棉球分別拭擦雞胚氣室外卵殼；3、取出兩只無菌平皿，并標記①和②，待用。4、大鑲子輕敲卵殼頂部然后當心去掉氣室外卵殼；5、消毒鑲子后當心撕破卵膜，兩人相互協作取出雞胚置于盛有Hanks液的平皿①中，當心去頭、內臟、爪和粘液及血球，洗滌后置于盛有Hanks液的平皿②中，再充分洗滌；6、取出洗凈的組織塊置于大青霉素瓶中，在火焰旁邊用無菌眼科剪刀將其剪成約0.5?lmni3的小塊（約250次），此時體積約0.5ml；用Hanks液洗滌兩次。7、依據10倍量加入0.25%胰蛋白酶，調整pH至約7.3?8.0（肉眼觀為肉紅色）蓋上瓶塞，寫好標記；8、將上述細胞瓶置于37c水浴中，起先計時，約15-30min,其間緩慢搖勻以充分消化。患者血清(S2)、100TCID50VSV病毒懸液、稀釋液、40孔平底細胞板、Hep-2細胞一瓶、吸管、加樣器等。四、試驗步驟四、試驗步驟1、40孔板每孔加稀釋液1001,作好標記，按圖進行。每塊板做2個血清SIS2標本：SI、S2OS比照1:20 1:40 1:80 1:160 1:3201:640 1:1280C比照V比照 2、取1:10滅活血清，第一孔加入1001,吹吸三次后吸出1001加入其次孔，吹吸三次吸出1001加入第三孔，依次直至第八孔，吸出1001棄去。第九孔細胞比照，第十孔病毒比照均不加血清。3、預先配好100TCID50VSV病毒懸液，依據每孔1001加入,C比照及S比照(即第1、9孔)不加病毒，V比照加100TCID501001o最終每孔總量2001,C比照及S比照補充稀釋液1001/孔。4、37℃作用1小時。5、利用此1小時制備Hep-2細胞懸液并加入上述混合液中。Hep-2一瓶，PBS洗滌二次 VTP1ml消化約5min后傾去 37℃至細胞從玻璃瓶脫落 加養分液6ml,細胞計數，成1106/ml,每孔加1001細胞懸液。37℃C02孵育，48h視察結果。六、試驗結果用倒置顯微鏡視察。首先視察比照：V比照（+++-++++）；S比照（-/）；C比照（-）o以病變作為指標，能抑制病毒CPE的血清最高稀釋度為中和抗體的效價（滴度）六、試驗結果消化停止的標記是：輕輕晃動后細胞懸起，呈云霧狀，很快聚集成團，表明細胞活力好。9、消化結束后，取出，稍沉淀，緩慢吸出上清，用Hanks液當心洗滌2?3次，可以盡量削減胰蛋白酶的殘留量，然后加入DMEM液約5mL用小頭吸管充分吹打，使細胞充分分散。吸上清；重復操作3?4次，收集細胞上清。10、 （1）上述細胞懸液自然沉降，待未消化徹底的組織塊沉入瓶底后，收集上清，并加入足量的小牛血清（終濃度為10%）,將細胞密度調到約1106個/ml。（2）經四層無菌紗布過濾后收集濾液，并加入足量的小牛血清（終濃度為10%），將細胞密度調到約1106個/ml；11、將上述制備好的細胞懸液平均安排到2只細胞瓶中，5ml/瓶，塞好螺口塞,留意生長面朝下，在非生長面上做好標記，包括細胞名稱，接種培育時間，組別及姓名等。12、細胞統一置于本室指定的CO2孵箱中培育。13、24h后視察細胞生長狀況，假如細胞長成單層，細胞界限清楚，大多數細胞為梭形并貼壁，布滿細胞瓶的生長面，說明細胞生長狀態良好。試驗三濾泡性口炎病毒（VSV）的增殖（純培育）試驗三濾泡性口炎病毒（VSV）的增殖（純培育）一、試驗目的一、試驗目的駕馭病毒在細胞內增殖的基本推斷方法。二、試驗原理二、試驗原理原代細胞最接近體內細胞的特性，因而對外界環境的變更也最敏感，因此比較適合病毒的增殖，藥物的作用機制等探討。病毒在細胞內增殖的檢測指標有細胞變更、紅細胞吸附、細胞代謝變更、干擾現象、免疫熒光法檢測等。由病毒引起的細胞病變稱細胞病變效應（cytopathiceffect,CPE）,常見的細胞形態學變更為細胞變圓、聚集、融合、裂解或脫落等。三、試驗材料（按三、試驗材料（按2人人/組的量發放）組的量發放）名稱200TCID50VSV5ml和1ml吸管數量0.1ml各1支備注含3%小牛血清的RPMI-1640DMEM液維持液100ml液或四、操作步驟四、操作步驟1、上述原代成纖維細胞培育24h后，一旦細胞完全貼壁生長良好后，則輕棄培育上清，換上細胞維持液（含3%小牛血清的RPMI-1640）,接種200TCID50的VSVO.1ml,在細胞瓶上標記換液時間，接種病毒量。正常比照也依據上述方法換上維持液。2、再接著培育，每間隔12?24h視察，直至全部細胞出現明顯的病變，顯微鏡視察細胞脫落，圓縮，則可停止培育。3、收集全班的病毒培育物于100nli無菌鹽水瓶中，寫好標記,置于一20C冰箱充分冷凍后再置于4℃冰箱或室溫下解凍，該過程稱為凍融。反復凍融三次后，細胞膜破壞，釋放出胞內病毒。低速離心，棄細胞碎片沉渣，收集上清即為病毒懸液。留樣測定病毒的TCID50o五、試驗結果五、試驗結果1、雞胚原代成纖維細胞的顯微鏡下視察。2、VSV攻擊雞胚原代成纖維細胞后，細胞病變效應（CPE）的視察。3、病毒收獲的方法。試驗四Hep-2細胞的傳代培育試驗四Hep-2細胞的傳代培育一、目的一、目的駕馭細胞傳代培育的方法及其應用。二、原理二、原理原代培育后由于細胞游出數量增加，細胞進行增殖，單層培育細胞相互匯合，整個瓶底漸漸被細胞覆蓋。這時須要進行分別培育，否則細胞會因生存空間不足或密度過大，養分障礙，影響細胞生長。細胞由原培育瓶內分別稀釋后傳到新的培育瓶的過程稱之為傳代；進行一次分別再培育稱之為傳一代。細胞培育傳代依據不同細胞實行不同的方法。貼壁生長的細胞用消化法傳代；部分貼壁生長的細胞用干脆吹打即可傳代；懸浮生長的細胞可以采納干脆吹打或離心分別后傳代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打傳代。三、材料三、材料名 稱傳代人喉癌上皮細胞（Hep-2）VTPDMEM液PBS血清5或10ml吸管1ml吸管數量1瓶/2人lml/2人100ml/2人1瓶/8人5ml/2人2支1支備注細胞培育瓶1只/2人四、操作步驟四、操作步驟1、將細胞生長面朝上輕輕倒掉上清，用PBS當心洗滌三次，留意吸管尖頭不要伸到細胞瓶中。2、用上述吸管吸取1mlVTP加入細胞瓶中，鋪滿整個細胞生長面即可；室溫或手握住消化，約3?5min。當細胞胞質回縮、細胞間隙增大后，即可停止消化，盡可能棄盡消化液，接著利用殘余的消化液消化，直至細胞大部分易在外力作用下從細胞瓶表面脫落下來為止。3、加入少量DMEM液細胞瓶中，用小頭吸管吹打瓶壁細胞以及脫落細胞充分使細胞勻稱，吹打時動作要溫柔不要用力過猛，盡可能不要出現泡沫。吸一滴細胞懸液于Ep管中。4、計數：用吸管吹打細胞懸液，取少許細胞懸液與等量0.04%臺盼蘭臺盼蘭混勻，在計數板上蓋玻片的一側加該細胞懸液，加樣量不要溢出蓋玻片，也不要過少或帶氣泡。計算細胞密度。用DMEM制備成1106/ml的細胞懸液，并按10%的量加入小牛血清。5、將上述細胞懸液分裝5ml到新細胞瓶中，塞好塞子，送培育箱培育，24h后視察。以備試驗五、六、七用。試驗五試驗五VSVTCID50滴定(注：此試驗和試驗五、六同時進行)滴定一、目的一、目的駕馭病毒TCID50滴定的基本原理和計算方法以及應用。二、原理二、原理多數病毒感染體外培育的細胞后，常引起細胞形態學變更，如細胞團縮、裂解和細胞腫大等，這種變更稱為病毒致病變效應(cytopathiceffect,CPE),可以干脆通過顯微鏡視察，亦可通過染色得以識別和推斷。CPE的程度可間接反映病毒的毒力，因此利用這種特征可以用來測定病毒的毒力。即能在細胞培育板孔或試管內引起半數細胞發生病變所需的病毒量定義為病毒的組織細胞感染指數(tissuecultureinfectiondose,TCID50)。測定時，首先在微量細胞板上培育敏感細胞，待細胞貼壁形成單層，棄上清。將待測病毒用維持液做10倍稀釋后加入細胞單層，逐日視察，直至病毒產生的CPE不再進展為止。詳細時間依據病毒的增殖特點而定，如腸道病毒增殖快速，一般48h即可；VSV增殖也較快，因此，48h?72h也可以視察、染色、計算。三、材料與器材三、材料與器材名稱數量備注Hep-2細胞試驗五傳代所得，自備/組自備/組自備/組自備水泡性口炎病毒(VSV)維持液，PBS,VTP細胞板tip頭微量移液器 1塊/組4盒/組四、操作步驟四、操作步驟1、制備細胞：方法同試驗五。一瓶細胞消化后加入8ml養分液即可制成所需細胞懸液。密度約為1106/ml。用微量