關于花藥和花粉培養第1頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三第一節花粉和花藥培養的概念和應用一、花粉和花藥培養的概念二、花藥和花粉培養的歷史三、花粉和花藥培養的應用第2頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三花粉和花藥的培養(pollenandantherculture)

是指在人工合成培養基上，改變花粉的發育途徑,使其不形成配子，而像體細胞一樣進行分裂、分化，由單個花粉粒發育成完整單倍體植株的技術。一、概念第3頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三第4頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三異同點：相同點：二者培養的目的一樣，都是要誘導花粉細胞發育成單倍體細胞，最后發育成單倍體植株。不同點：

①花藥培養屬器官培養，花藥是植物花的雄性器官，包括體細胞性質的藥壁和藥隔組織，以及雄性性細胞的花粉粒；花粉培養屬細胞培養。

②花粉培養沒有藥壁組織干擾，可計數小孢子產胚率，可觀察雄核發育的全過程。

③單倍體產量高。

④花粉培養技術更復雜，比花藥培養難度大。第5頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三二、植物花藥/花粉培養歷史Guha和Maheshwari（1964）曼陀羅花藥培養Nitsch和Norreel(1973)煙草花粉培養（游離小孢子培養）Chu（1973）小麥花粉培養（早期花藥培養主要依靠小孢子的自然胚胎發生產生單倍體，能自發形成胚胎發生的基因頻率較低，效率極低）80年代后期到90年代期間，花培技術迅速發展。許多作物小孢子培養已經成功。十字花科、麥類、水稻、玉米等。90年代，一些先前被認為是不易進行小孢子培養的基因型也相續成功Konzak(1999)。第6頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三通過花藥培養育成的甜椒新品種

：

海花三號

第7頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三三、花藥和花粉培養的應用1)誘導形成單倍體，快速獲得純系，縮短育種周期；供體植株小孢子（n）花培花粉植株（n）雄核發育自然加倍人工加倍純合植株DH（2n）一年內獲得純系常規育種需4-6年獲得純系，而小孢子培養僅需一年。1、作物育種第8頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三常規育種在雜交F5、F6代開始選擇；花藥培養在F1或F2代進行培養，再人工加倍處理．縮短育種周期3--5年克服后代分離，大大縮短育種周期第9頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三花粉單倍體是純合配子體，從來源于配子體的植株中選擇某一種基因型的概率是(1/2)n，而從常規雜交F2代群體中，選擇某一基因型的概率為(1/2)2n，故單倍體育種的選擇效率為常規育種的2n倍。2)提高目標基因型的選擇效率第10頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三例子：二倍體供體植株基因型為AaBb，若要從后代中選擇基因為AAbb的純合單株

常規方法：AAbb出現的概率為1/16，并且不能將AAbb與Aabb、aAbb區分開。

AB

aB

Ab

abAB AABB AaBB AABb AaBbaB aABB aaBB aABb aaBbAb AabB AabB AAbb Aabbab aAbB aabBaAbb aabb第11頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三例子：

二倍體供體植株基因型為AaBb，若要從后代中選擇基因為AAbb的純合單株

單倍體方法：AAbb出現的概率為1/4。

單倍體

二倍體

AB-------------------------->AABB

aB---------------------------->aaBB

Ab---------------------------->AAbb ab---------------------------->

aabb供體親本AaBb花培

從來源于配子體的植株中選擇某一種基因型的概率是(1/2)n，而從常規雜交F2代群體中，選擇某一基因型的概率為(1/2)2n，故單倍體育種的選擇效率為常規育種的2n倍。第12頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三

3)誘變育種中的作用植株不受顯隱性的影響，在誘變育種中能在當代及時獲得突變個體，染色體加倍后成為穩定的純系。第13頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三可探索親本染色體組的構成。分析單倍體植物減數分裂時，形成二價體的數目和形狀，能確定染色體組內是否存在同源染色體。2、物種進化研究

第14頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三

單倍體植株中基因不受顯隱性的影響，每一個基因的作用均能表現出來。能用來研究基因的性質及其作用。還可用于基因的劑量效應分析。3、遺傳分析

第15頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三4、構建連鎖圖譜

雙單倍體（DH）群體是永久性群體，能有效地用于遺傳圖譜的構建。能直接表達外源基因，不受顯隱性影響。5、植物基因克隆篩選

第16頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三第二節花粉孢子體發育途徑概念：花粉孢子體發育途徑（雄核發育途徑）

花粉是產生花粉植株的原始細胞，其第一次有絲分裂，在本質上與合子的第一次孢子體分裂相似，把花粉形成植株的途徑稱為花粉孢子體發育途徑，也叫雄核發育途徑。第17頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三一、花粉發育的階段花粉離體培養時，雄核發育最適宜的時期一般是第一次有絲分裂或之前。第18頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三二、雄核發育途徑1、A途徑小孢子第一次有絲分裂為非均等分裂，形成營養細胞和生殖細胞

（1）A-V途徑由營養細胞重復分裂形成單倍體（2）A-G途徑由生殖細胞重復分裂形成單倍體（3）A-VG途徑（E途徑）由營養細胞和生殖細胞各自獨立分裂，共同形成單倍體（4）C途徑營養細胞和生殖細胞通過核融合，形成多倍體植株2、B途徑

小孢子第一次有絲分裂為均等分裂，形成大小相近的兩個細胞。然后由這兩細胞邊續分裂形成單倍體植株，或者核融合形成多倍體植株第19頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三第20頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三

1、胚狀體發育途徑

小孢子經歷胚發生的各個階段，最后子葉展開，形成花粉植株。2、愈傷組織發育途徑

小孢子分裂數次形成愈傷，再分化形成花粉植株。此途徑產生的植株會出現變異且倍性復雜。三、花粉植株形態發生方式第21頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三胚狀體發育途徑部分花藥通過胚狀體途徑形成小植株煙草花藥培養第22頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三愈傷組織發育途徑部分花藥產生愈傷組織接種在平板上的水稻花藥水稻花藥培養第23頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三愈傷組織轉接種到再生培養基愈傷組織分化形成再生植株水稻花藥培養第24頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三第三節花藥和花粉培養方法一、花藥培養二、花粉培養三、白化苗現象四、影響雄核發育和花粉花藥培養的因素第25頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三一、花藥培養1、取材

鏡檢，根據花粉的發育時期，選取大小適宜的花蕾。

2、消毒

70％酒精擦洗花蕾表面，或70％酒精浸泡30-60s后在1％次氯酸鈉溶液中浸泡10-20min或在0.1％的氯化汞溶液中消毒3-10min，無菌水沖洗3-5次。

3、培養

固體或液體培養基均可。先進行脫分化培養，至小孢子大量分裂形成胚或愈傷，并突破花藥壁表面，形成突出物（2-3周）；后轉入分化培養基培養，形成小植株。第26頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三二、花粉培養(一)花粉的分離與純化

1、自然散落法(漂浮培養散落小孢子收集法)

將花藥接種在預處理液或液體培養基上，待花粉自動散落后，收集培養。2、擠壓法

在燒杯或研缽中擠壓花藥，將花粉擠出后收集培養。第27頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三1）磁攪拌法

用磁力攪拌器攪拌培養液中的花藥，使花粉游離出來；2）超速旋切法

通過攪拌器中的高速旋轉刀具破碎花蕾、穗子、花藥，使小孢子游離出來（此法應用最廣）。4、小孢子純化對上述方法獲得的小孢子混合物進行分級過篩、梯度離心處理純化小孢子3、機械游離第28頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三梯度離心前（小孢子形態、活力不一致）30%蔗糖梯度離心后（獲得均一的小孢子群體）第29頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三(二)花粉培養方式1、平板培養花粉置瓊脂固化培養基上培養。2、液體培養花粉懸浮在液體培養基中培養，需震蕩，以利通氣。3、雙層培養花粉置固體-液體雙層培養基上培養。培養基制作方法：先鋪一層瓊脂固體培養基，凝固后，在表面加入少量液體培養基。

4、看護培養

利用花藥或花藥愈傷組織釋放出的活性物質促進花粉小孢子發育。用一塊活躍生長的愈傷組織來看護單個細胞，并使其生長和增殖。這個愈傷組織塊稱為看護愈傷組織。第30頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三1）在一個培養瓶中加入一定量厚的固體培養基，滅菌后備用。2）在無菌條件下，將一小塊（1cm3）活躍生長的愈傷組織接種到培養基上，再在愈傷組織塊上放一片（1cm2）已滅菌的濾紙，放置過夜。3）將分離的花粉接種到已經充分吸收愈傷組織滲透液的濾紙上。4）單細胞分裂形成肉眼可見的小細胞團后，即轉移到新鮮培養基上培養，恒溫培養，得到單細胞無性系。具體方法2.第31頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三5、微室培養

利用小的蓋玻片和凹穴載玻片形成微室進行花粉培養。6、條件培養基培養

利用培養過花藥的液體培養基或含失活花藥提取物的培養基上培養。花藥條件培養基、子房條件培養等。第32頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三花粉培養過程取花蕾（鏡檢）預培養數天取花藥消毒分離花粉接種培養愈傷組織發生第33頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三三、白化苗現象第34頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三（一）白化苗產生的影響因素及機理1、內因 供體植株基因型（如秈稻比粳稻白苗率高）、花粉發育時期。2、外因 預處理、培養基成分、激素水平與種類、培養條件和方法、愈傷組織轉分化時間等。3、機理 核基因起關鍵作用，導致質體DNA缺失，產生白苗。另外地、無性系變異也可能是原因之一。（二）白化苗的控制

通過對花粉發育時期、預處理、培養基成分等因素進行調控。第35頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三四、影響雄核發育和花粉花藥培養的因素（一）基因型

植物基因型是影響雄核發育的最重要的因素之一。同一物種中的不同基因型對小孢子離體誘導反應差異較大。如在水稻中，秈稻花粉培養力遠低于糯稻。第36頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三小孢子發育時期對誘導雄核發育非常重要。（二）花粉發育時期適宜時期：單核期,尤其是單核中、晚期(單核靠邊期)第37頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三蕓苔屬植物Brassicanapus不同基因型的小孢子產胚率比較Topas

10,000-200,000 1-20Westar 1000-10,0000.1-1Delta 100-10,000 0.01-1Bounty10-1000.001-0.01基因型 胚狀體數量/106小孢子成苗率（%）第38頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三1、植株生長條件光溫等因素均能影響花藥培養力。一般處于適宜生長條件（如溫室中）較好。但物種間存在差異。2、植株生長時期一般是開花始期優于開花末期。3、P花粉的頻率不同溫度、日照時數、氮饑餓及生長物質處理提高P花粉的數量（三）供體植株生長條件和生理狀態

第39頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三隨著細胞體積迅速增大，細胞核由中央位置推向一邊，即單核靠邊期。。雄配子體的發育營養細胞生殖細胞精子第40頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三四分體:醋酸洋紅染色四分體:Alexander’s染色單核期雙核期成熟花粉粒處于不同發育時期的煙草小孢子第41頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三單核晚期液泡第一次有絲分裂后期雙核早期雙核中期生殖核生殖核營養核第42頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三一般而言，單核期（第一次有絲分裂前）對誘導反應最敏感，為最佳培養期。形成雙核后，在合適的條件，主要由營養細胞分裂產生胚狀體。

第43頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三不同物種誘導胚胎發生的最佳小孢子發育時期發育時期物種減數分裂期草莓、番茄四分孢子期葡萄單核早中期石刁柏、油菜、大麥、天仙子、馬鈴薯單核晚期荔枝、茄子、青椒、小麥單核早期至晚期煙草單核早期至雙核期梨、水稻、甘藍四分孢子期至雙核期玉米第44頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三對不同發育階段的花藥進行培養測試確定最佳小孢子發育時期的形態特征注意形態特征會因品種、發育狀態、環境條件的變化而發生變化處于不同發育階段的煙草花芽花粉發育時期的確定第45頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三單核期的確定：

根據細胞觀察推測，雙核期的花粉中開始積累淀粉，不能使花粉發育成植株。通常采用醋酸洋紅或碘化鉀染色，再壓片鏡檢，以確定花粉的發育時期。

但是接種前不可能把所有的花粉都進行一次發育時期的鏡檢，通常是按照花蕾長度大小與花粉發育年齡的相關性，實際操作中取一定大小的花蕾進行的。第46頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三A.通過顯微鏡下觀察確定小孢子發育時期

醋酸洋紅染色DAPI

染色第47頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三B.通過花蕾外部特征確定小孢子發育時期

花蕾的外部形態特征與小孢子的發育時期有一定的相關性，花蕾萼裂基部與花冠頂部之差可以作為判斷小孢子發育時期的基本指標。

第48頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三2、化學物質處理包括高糖、甘露醇、秋水仙素、乙烯利等進行處理。甘露醇僅能維持滲透壓，不能提供碳源，其主要原理是造成小孢子營養饑餓，從而使小孢子去分化。3、其它包括γ射線、離心、磁場等。

預處理方法：1、高低溫處理第49頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三（四）培養基

1.基本培養基

主要為N6和MS培養基。MS和H培養基：適合雙子葉植物花藥培養；B5培養基：適合豆科和十字花科花藥培養；N6培養基：適合禾谷類作物的花藥培養。Nitsch培養基:適合蕓薹屬和曼陀羅屬。高濃度的NH4+顯著抑制花粉愈傷組織形成。鐵鹽對花粉胚狀體發育很重要。活性炭促進胚狀體發育。

第50頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三包括蔗糖、麥芽糖、纖維二糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等。不同作物所需最適的碳源種類及濃度的所差異。在辣椒花藥培養中以6%的蔗糖濃度對胚狀體的誘導率為最高。在番茄花藥培養中需要量高達14％。其原因是花粉母細胞的滲透壓比花絲等體細胞高的緣故，即高濃度的蔗糖不利于藥壁、花絲等體細胞的生長，而利于花粉的生長。一般認為單子葉植物比雙子葉植物需糖的濃度要高。玉米中蔗糖效果最好；而麥類作物中，麥芽糖似乎為最好的碳源。較高濃度蔗糖可誘導花粉形成愈傷組織；

較低濃度蔗糖可使愈傷組織分化成苗。2.碳源第51頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三3、激素

細胞分裂素可促進胚狀體形成；

生長素可誘導愈傷組織形成。

細胞分裂素與生長素比值高時可誘導愈傷組織分化苗4、氨基酸5、活性碳6、pH

第52頁，講稿共58頁，2023年5