左旋咪唑誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎大鼠脊髓內(nèi)單個(gè)核細(xì)胞上CD4，CD28和CD152表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究【摘要】目的觀察左旋咪唑?qū)?shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎大鼠脊髓內(nèi)單個(gè)核細(xì)胞上CD4，CD28和CD152表達(dá)的影響，并探討LMS誘發(fā)炎性脫髓鞘白質(zhì)腦病發(fā)病機(jī)制。方法采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EAE大鼠脊髓單個(gè)核細(xì)胞上CD4，CD28和CD152的表達(dá)水平。結(jié)果LMS同時(shí)給藥組和預(yù)處理的EAE組大鼠脊髓內(nèi)單個(gè)核細(xì)胞上CD4和CD28的表達(dá)水平，均明顯高于非LMS處理的EAE模型組。結(jié)論LMS能促進(jìn)EAE大鼠脊髓內(nèi)單個(gè)核細(xì)胞上CD4和CD28的表達(dá)，提示LMS上調(diào)CD4和CD28的表達(dá)與可能LMS誘發(fā)的炎性脫髓鞘白質(zhì)腦病有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】左旋咪唑?qū)嶒?yàn)變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎

Abstract：ObjectiveToobservetheeffectoflevamisole(LMS)onexpressionsofCD4,CD28andCD152onmononuclearcellsinspinalcordsofratswithexperimentalallergicencephalomyelitis(EAE),andstudythepathogenesisofinflammatorydemyelinatingleukoencephalopathyinducedbyLMS.MethodsUsingflowcytometry,wedetectedlevelsofCD4,CD28,CD152inmononuclearcellsinspinalcordsofEAEexpressionlevelofEAEratstreatedwithLMSshowedhigherthanthatofratstreatedwithoutcouldexacerbateEAEbyenhancingtheexpressionsofCD4andCD28inspinalcordsofEAErats,andup-regulationofexpressionsofCD4andCD28mayplayacrucialroleininflammatorydemyelinatingleukoencephalopathyinducedbyLMS.

Keywords：Levamisole;Experimentalallergicencephalomyelitis

左旋咪唑(Levamisole,LMS)為四咪唑的左旋異構(gòu)體，是國(guó)家和WHO抗蠕蟲(chóng)病基本藥物，作為廣譜驅(qū)腸蟲(chóng)藥使用于。1971年，Renoux發(fā)現(xiàn)LMS具有增強(qiáng)免疫的作用,其作為免疫增強(qiáng)劑被推廣用于慢性感染、皮膚疾病、自身免疫性疾病及腫瘤等疾病的免疫調(diào)節(jié)輔助治療，長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為安全低毒。但近二十年來(lái)，國(guó)內(nèi)外發(fā)現(xiàn)LMS能導(dǎo)致嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙—左旋咪唑性白質(zhì)腦病。LMS與LMS性白質(zhì)腦病的因果關(guān)系，已被系統(tǒng)的藥行病學(xué)研究所證實(shí)報(bào)道的標(biāo)準(zhǔn)，定為0～5分：無(wú)明顯異常者為0分，尾巴無(wú)力者為1分，輕微后肢無(wú)力者為2分，嚴(yán)重后肢麻痹者為3分，四肢麻痹者為4分，死亡者為5分。

大鼠腦、脊髓的病理檢查

將SD大鼠以100g/L水合氯醛腹腔注射麻醉后,用300ml預(yù)冷的GKN液(8g/LNaCl，g/LKCl，g/LNa2HPO4·12H2O，g/LNaH2PO4，H2O，2g/L葡萄糖及2000U/L肝素，pH)經(jīng)主動(dòng)脈灌流至無(wú)血液流出時(shí)，小心取出脊髓及腦。取一小段頸髓及部分腦組織依次經(jīng)40g/L多聚甲醛固定、石蠟包埋及常規(guī)蘇木素-伊紅染色(切片厚5μm)和LuxolFastBlue髓鞘染色(切片厚10μm)后，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行病檢查。

脊髓單個(gè)核細(xì)胞上CD4，CD28及CD152表達(dá)的檢測(cè)按Pope等［3］報(bào)道的方法制備脊髓單個(gè)核細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×109/L。于100μl單個(gè)核細(xì)胞中加入不同熒光素標(biāo)記的抗CD4，CD28及CD152抗體各μg避光孵育30min，用PBS清洗1次，再加入10g/L多聚甲醛200μl待測(cè)。同時(shí)在含有100μl單核細(xì)胞的另1管中加入三種具有相對(duì)應(yīng)熒光標(biāo)志的小鼠IgG1抗體避光孵育作為陰性對(duì)照。最后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用Cell對(duì)獲取的結(jié)果進(jìn)行分析,每份樣品分析20000個(gè)細(xì)胞，減去陰性對(duì)照的結(jié)果后，以CD+4，CD+28，CD+152細(xì)胞數(shù)的百分比表示CD4，CD28，CD152的表達(dá)水平。

學(xué)處理

各種檢測(cè)所獲數(shù)據(jù)均以±s表示，組間比較采用方差分析(One-WayANOVA)。大鼠的發(fā)病率采用Chisquare檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)均采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。

3結(jié)果

SD大鼠的發(fā)病及神經(jīng)受損情況

對(duì)照組大鼠未出現(xiàn)癥狀，體質(zhì)量持續(xù)增長(zhǎng)，活動(dòng)度正常。第1，2組(即LMS同時(shí)給藥組和LMS預(yù)處理組)、第3組(EAE模型組)大鼠于免疫后12d，開(kāi)始陸續(xù)發(fā)病。發(fā)病前2～3d，出現(xiàn)進(jìn)食減少、體重下降、毛發(fā)失去光澤甚至豎毛，并出現(xiàn)尾巴無(wú)力、癱瘓,繼而后肢無(wú)力及癱瘓；多伴有大小便失禁，部分累及前肢。第1，2組大鼠的病情進(jìn)展快，神經(jīng)功能損害重，平均最大評(píng)分明顯高于第3組；但發(fā)病率和發(fā)病的潛伏期無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組大鼠的發(fā)病及神經(jīng)受損情況見(jiàn)表1。表1SD大鼠EAE的發(fā)病情況及癥狀評(píng)分

病改變對(duì)照組大鼠腦及脊髓的病理檢查，未發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及脫髓鞘改變。EAE模型組大鼠的腦及脊髓實(shí)質(zhì)內(nèi)，小血管周?chē)休^多的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞為主，典型者呈血管袖套樣改變，髓鞘染色發(fā)現(xiàn)局灶性脫髓鞘。LMS同時(shí)給藥組和LMS預(yù)處理組中炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)及脫髓鞘改變更明顯，可見(jiàn)到較多的血管袖套樣改變，神經(jīng)細(xì)胞腫脹、變性、壞死，并可見(jiàn)膠質(zhì)細(xì)胞增生、小結(jié)節(jié)形成等。

EAE大鼠脊髓內(nèi)單個(gè)核細(xì)胞上CD4，CD28，CD152的表達(dá)EAE模型組SD大鼠脊髓內(nèi)單個(gè)核細(xì)胞上CD4的表達(dá)最高，CD28的表達(dá)也較高，而CD152的表達(dá)水平最低。LMS同時(shí)給藥組和LMS預(yù)處理組大鼠脊髓內(nèi)單個(gè)核細(xì)胞上CD4，CD28的表達(dá)水平較EAE模型組明顯增高，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而CD152的表達(dá)無(wú)明顯變化見(jiàn)表2。表2EAE大鼠脊髓單個(gè)核細(xì)胞上CD4，CD28及CD152的表達(dá)

4討論

EAE是CD+4T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病。T細(xì)胞的活化需要兩個(gè)刺激信號(hào)：第1信號(hào)為T(mén)細(xì)胞表面的TCR/CD3復(fù)合物與抗原提呈細(xì)胞上MHC-Ⅱ類抗原及抗原肽相結(jié)合；第2信號(hào)又稱協(xié)同刺激信號(hào)，為T(mén)細(xì)胞上的協(xié)同刺激分子與APC表面的配體相結(jié)合所提供。雖然還有4-1BB等其它協(xié)同刺激分子參與T細(xì)胞的活化和增殖，但CD28是誘導(dǎo)T細(xì)胞的活化的重要協(xié)同刺激分子，而且可能優(yōu)先誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞活化。CD28/B7協(xié)同刺激途徑激活可明顯促進(jìn)IL-2合成，上調(diào)抗凋亡分子Bcl-xL，促進(jìn)T細(xì)胞活化,促進(jìn)EAE的發(fā)病。CD28-/-或CD28肽類似物可干擾其與配體結(jié)合明顯抑制EAE的發(fā)病［4］。

我們發(fā)現(xiàn)，急性EAE大鼠病理改變主要為腦、脊髓實(shí)質(zhì)內(nèi)小血管周?chē)仔约?xì)胞的浸潤(rùn)，典型者呈血管袖套樣改變，髓鞘染色可發(fā)現(xiàn)局灶性脫髓鞘。脊髓提取的單個(gè)核細(xì)胞(主要為淋巴細(xì)胞)中以CD4+細(xì)胞為主，支持EAE主要為CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘為特征的自身免疫性疾病。在給予GPSCH-CFA致敏的基礎(chǔ)上，同時(shí)給予10mg/kg的LMS后可明顯加重EAE大鼠的癥狀，平均最大評(píng)分明顯增高(P＜0.01)。本研究首次發(fā)現(xiàn)，給予LMS預(yù)處理也能加重EAE大鼠的癥狀和病理改變。LMS同時(shí)給藥及LMS預(yù)處理組均可明顯促進(jìn)SD大鼠EAE急性期脊髓內(nèi)單個(gè)核細(xì)胞上CD28和CD4的表達(dá)，而對(duì)CD152的表達(dá)無(wú)明顯影響，故CD4+/CD152+細(xì)胞的比值升高。與EAE模型組相比較，LMS同時(shí)給藥組及LMS預(yù)處理組大鼠中CD28+和CD4+細(xì)胞數(shù)增加近1倍，與其神經(jīng)受損的情況及病理改變相一致。LMS作為一種免疫刺激劑，能誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，增加CD4的表達(dá)，提高細(xì)胞免疫水平［5］。CD28表達(dá)的增加，通過(guò)CD28/B7-1或B7-2協(xié)同刺激途徑，可促進(jìn)更多T細(xì)胞活化增殖，減少其凋亡，并促進(jìn)其分泌更多的促炎細(xì)胞因子(如IL-2)等，進(jìn)一步加重EAE的炎癥過(guò)程。

以上表明，LMS能上調(diào)急性期EAE大鼠脊髓內(nèi)單個(gè)核細(xì)胞上CD28和CD4的表達(dá)，提示其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病中具有增強(qiáng)免疫病理的作用，可能是其誘發(fā)炎性脫髓鞘白質(zhì)腦病發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)。

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