1、提取生物大分子的基本過程和方法；2、凝膠色譜法、電泳法的原理。1、凝膠是什么？一些微小多孔的球體（由多糖類化合物構成的，如葡聚糖、瓊脂糖，內含許多貫穿的通道）2、原理：根據被分離物質的相對分子質量大小，利用具有網狀結構的凝膠的分子篩作用，來進行分離。㈠凝膠色譜法（分配色譜法）：基礎知識凝膠色譜法分離蛋白質的原理小蛋白質大蛋白質混合物上柱洗脫大分子流動快小分子流動慢收集大分子收集小分子即：移動速度與相對分子質量成_____。正比

能夠抵制（）對溶液（）的影響，維持PH基本不變。目的：保持體外溶液的pH與體內環境中的pH基本一致。外界的酸或堿pH1、概念：

在一定的范圍內，能對抗外來少量強酸、強堿或稍加稀釋不引起溶液PH發生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。㈡緩沖溶液：2、作用：通常由（）種緩沖劑溶解于水中配制而成。調節緩沖劑的（）就可以制得（）使用的緩沖液。1－2使用比例在不同pH范圍內3、緩沖溶液的配制NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3說出人體血液中的緩沖對。思考1、概念：

指帶電粒子在電場作用下發生遷移的過程。㈢電泳：2、原理：

許多重要的生物大分子，如()等都具有()在()下，這些基團會帶上()。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其()移動。電泳利用了待分離樣品中各種分子()以及分子本身()、()的不同使帶電分子產生不同的()，從而實現樣品中各種分子的分離。多肽、核酸可解離的基團正電或負電所帶電荷相反的電極帶電性質的差異大小遷移速度一定的pH形狀聚丙烯酰胺凝膠：是由單體丙烯酰胺和交聯劑N，N′—亞甲基雙丙烯酰胺在引發劑(過硫酸銨）和催化劑（四甲基已二胺）的作用下聚合交聯成三維網狀結構的凝膠蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。常用電泳方法：瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。

為了消除凈電荷對遷移率的影響可以在凝膠中加入()。它能使蛋白質發生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質復合體在SDS的作用下會解聚成單條肽鏈，因此測定的結果只是()。SDS能與各種蛋白質形成蛋白質—SDS復合物，SDS所帶負電荷的量大大超過了蛋白質分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于()。SDS分子的大小單條肽鏈的分子量測定蛋白質的相對分子質量常用：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳①瓊脂糖凝膠電泳操作簡單，電泳速度快，樣品不需要事先處理；電泳后區帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測定。②測定蛋白質的相對分子質量常用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，這是因為該方法分離蛋白質完全取決于分子的大小，而非所帶電荷的性質和分子的大小、形狀。特別提醒利用凝膠色譜法分離蛋白質時，相對分子質量小的先洗脫出來()在電泳過程中，蛋白質分子的移動速度，與分子本身的大小和形狀無關，而與所帶電荷的差異有關()判斷正誤：××在SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳中，電泳遷移率完全取決于分子的大小()在血紅蛋白分離過程中，使用緩沖液的作用是維持溶液濃度不變()判斷正誤：×√蛋白質的提取和分離一般分為四步：1.樣品處理樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定實驗操作哺乳動物的成熟紅細胞無細胞核，結構簡單，血紅蛋白含量豐富，便于提取血紅蛋白。用哺乳動物的紅細胞提取血紅蛋白的原因是什么？實驗操作血液有哪些成分？血液血

漿水分其他

物質血漿蛋白、無機鹽、葡萄糖等血

細胞白細胞血小板紅細胞(最多)血紅蛋白(90％)兩個α－肽鏈兩個β一肽鏈四個亞鐵血紅素基團血液有哪些成分？血紅蛋白每個肽鏈環繞(),此基團可攜帶()。血紅蛋白因含有()而呈紅色一個亞鐵血紅素基團血紅素一分子氧或一分子CO2①目的：去除()②方法：雜蛋白(1)紅細胞的洗滌血液100mL3g檸檬酸鈉低速離心2min紅細胞血漿吸出血漿紅細胞5倍體積生理鹽水緩慢攪拌10min重復洗滌3次，直至上清液沒有黃色燒杯

加()到()體積，再加40％體積的()(瓦解細胞膜)，置于()上充分攪拌10分鐘(加速細胞破裂)，細胞破裂釋放出血紅蛋白。(2)血紅蛋白的釋放原血液甲苯磁力攪拌器蒸餾水(3)分離血紅蛋白溶液紅細胞混合液高速離心10min除去脂類物質離心管過濾血紅蛋白分液漏斗有機溶劑：無色透明的甲苯層脂類物質：白色脂溶性物質沉淀層血紅蛋白溶液：紅色透明液體紅細胞破碎物沉淀：暗紅色沉淀物離心后分層示意圖取1ml的血紅蛋白溶液裝入()中，將透析袋放入盛有300ml的物質的量濃度為20mmol/L的()中，pH為()，透析12小時，目的是(見P67旁欄)：()或用于更換樣品中的()。透析袋一般用硝酸纖維素制成，又稱玻璃紙。除去樣品中分子量較小的雜質透析袋磷酸緩沖液7.0緩沖液——透析2.粗分離利用透析袋透析1）凝膠色譜柱的制作——凝膠色譜法

3.純化2）凝膠色譜柱的裝填3）樣品的加入和洗脫1）凝膠色譜柱的制作——凝膠色譜法

3.純化打孔→挖穴→安管→覆網→紗包→插管

底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實尼龍網，還會導致液體殘留，蛋白質分離不徹底。注意2）凝膠色譜柱填料的處理固定色譜柱配置凝膠懸浮液裝填洗滌平衡↓↓↓(緊密，不得有氣泡)氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質的洗脫次序，降低分離效果。P70磷酸緩沖液(pH為7.0)沸水浴加熱P69-70

緩沖液液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內的流動與最終生物大分子物質的分離效果。不能發生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現象，否則重新填裝。注意

使用的是磷酸緩沖液，目的是利用緩沖液模擬細胞內的PH環境，保證血紅蛋白的正常結構和功能，便于觀察（紅色）和材料的科學研究。

在提取血紅蛋白實驗中用的緩沖液是什么？它的目的是什么？思考3）樣品加入與洗脫①調液面50cm高

②加樣、調液面③洗脫④收集②加透析樣品注意正確的加樣操作：①不要觸及破壞凝膠面②貼壁加樣③使吸管管口沿管壁環繞移動注意收集得到的純化后的蛋白——SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳P694.純度鑒定

判斷純化的蛋白質是否達到要求，需要進行蛋白質純度的鑒定。鑒定方法中使用最多的是SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳。紅細胞的洗滌次數不能過少，否則無法除去血漿蛋白；要低速、短時離心，否則會使白細胞等一同沉淀，達不到分離的效果()色譜柱的裝填應盡量緊密，減小顆粒間隙，無氣泡，洗脫液不能斷流()色譜柱成功的標志：紅色區帶均勻一致地移動()判斷正誤：√√√操作提示實驗結果分析與評價1.血液樣品的處理分層明顯→樣品處理完成2.凝膠色譜柱的裝填放一支與凝膠柱垂直的日光燈檢查；加入大分子有色物質如藍色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖，若色帶均勻、狹窄、平整，說明裝填成功。3.血紅蛋白的分離血紅蛋白的紅色區帶均勻、狹窄、平整，隨洗脫液緩慢流出，則分離成功。

讓血紅蛋白處在穩定的pH范圍內，維持結構和功能。

1.在分離血紅蛋白的整個過程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什么？

思考

血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。

2.與其他真核細胞相比，紅細胞有什么特點？這一特點對你進行蛋白質的分離有什么意義？

思考

血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即:樣品的處理；再經過透析去除分子量較小的雜質，即樣品的粗分離；然后通過凝膠色譜法將相對分子質量較大的雜質蛋白除去，即:樣品的純化；最后經聚丙烯酰胺凝膠電