蛋白質含量測定考馬斯亮藍染色方法實驗室規則考勤實驗操作實驗室安全（儀器、藥品、水、電等）值日（桌面、地面、門、窗、水、電等）考試蛋白質含量測定考馬斯亮藍染色方法①實驗名稱②實驗目的③實驗原理（簡述)④實驗材料、儀器及其試劑⑤實驗方法與操作步驟（工藝流程圖或表格方式）⑥實驗結果及分析（實驗現象或實驗結果數據整理、歸納、分析和對比）⑦討論（實驗方法、操作步驟、實驗正(異)常結果、建議等）標準的實驗報告應該簡潔明了地給出使別人能夠重復你的實驗所需要的全部信息。

關于實驗報告:

要用自己的實驗記錄認真地寫出一份實驗報告，不得互相抄襲。實驗報告的內容:蛋白質含量測定考馬斯亮藍染色方法蛋白質（protein）：是由α-氨基酸按一定序列通過肽鍵縮合而成的具有一定功能的生物大分子。蛋白質的組成單位：氨基酸。蛋白質的元素組成元素CHONSP其他百分比50-556-720-23160-30-3蛋白質含量測定考馬斯亮藍染色方法根據功能不同，蛋白質可分為：1、結構蛋白質：建造和維持生物體結構的蛋白質；2、酶：具有催化功能的蛋白質；3、調節蛋白質：具有調控功能的蛋白質；4、轉運蛋白質。蛋白質含量測定考馬斯亮藍染色方法

1、學習利用考馬斯亮藍G-250染色法測定蛋白質含量的原理及方法；

2、掌握分光光度計的使用方法；

3、掌握標準曲線的繪制。

一、實驗目的：蛋白質含量測定考馬斯亮藍染色方法

考馬斯亮藍G-250在酸性溶液中游離狀態下為棕紅色。當它與蛋白質通過范德華鍵結合后變為藍色.

蛋白質染料復合物對595nm可見光有最大光吸收.

在一定范圍內（10-1000ug/ml）其OD595nm值與蛋白質含量成正比，故可用分光光度法進行蛋白質的定量測定。二、實驗原理：蛋白質含量測定考馬斯亮藍染色方法考馬斯亮藍G-250染色法原理465nm595nm酸性環境下呈棕紅色與蛋白質結合變藍色加入蛋白質蛋白質含量測定考馬斯亮藍染色方法雙縮脲反應：Folin-酚試劑法（Lowry法）：紫外吸收法：微量凱式定氮法：其他蛋白質含量的測定方法蛋白質含量測定考馬斯亮藍染色方法（1）雙縮脲法：

原理是蛋白質含有兩個以上的肽鍵（-CO-NH-）因此，有雙縮脲反應，在堿性溶液中蛋白質與Cu2+形成紫色絡合物，其顏色深淺與蛋白質含量成正比，故可以用來測定蛋白質含量.幾種其他蛋白質含量的測定方法蛋白質含量測定考馬斯亮藍染色方法（2）Folin-酚試劑法（Lowry法）：

是雙縮脲法的發展，第一步涉及到堿性溶液中銅蛋白質復合物的形成，然后這個復合物還原磷鉬酸－磷鎢酸試劑，產生深藍色（鉬藍和鎢藍混合物）比雙縮脲法靈敏，但費時；蛋白質含量測定考馬斯亮藍染色方法（3）紫外吸收法：

蛋白質中Trp，Phe，Tyr的殘基中的苯環含有共軛雙鍵，吸收高峰在280nm處，所以蛋白質具有吸收紫外光的性質，并且蛋白質溶液的光吸收值與其含量成正比，可用作定量測定。簡單、靈敏、快速、不耗樣品，低濃度的鹽類不干擾。

蛋白質含量測定考馬斯亮藍染色方法（4）微量凱式定氮法：

根據蛋白質的平均含氮量為16%，因此，測得1g蛋白氮，相當于蛋白質。

蛋白質含量測定考馬斯亮藍染色方法

1、實驗材料：綠豆芽、小麥種子、葡萄、蘋果

2、儀器：(1)S-22pc可見光分光光度計(2)研缽

(3)離心機(4)試管(5)容量瓶等

3、試劑：（1）染色液：考馬斯亮藍G-250

(100mg考馬斯亮藍溶于50ml95%乙醇，加100ml85%磷酸，加水稀釋至1L)（2）濃度：的牛血清白蛋白標準溶液。三、實驗材料、儀器和試劑：蛋白質含量測定考馬斯亮藍染色方法1、制作標準曲線：

取7支試管，依次分別加入，的牛血清蛋白溶液，用水補足到，每管均再加5ml染色液，立即搖勻，置室溫下放置5分鐘。然后測各管的OD595nm值，繪制標準曲線。四、實驗步驟：

蛋白質含量測定考馬斯亮藍染色方法標準曲線的繪制目的：得到樣品中蛋白質的濃度。首先，用一組已知濃度的蛋白質溶液與考馬斯亮藍G-250反應,然后在595nm處測定吸光度（OD）。其次，繪制濃度與吸光度對應的曲線圖。最后，測定樣品蛋白質的吸光度然后在曲線上找到對應的濃度。蛋白質含量測定考馬斯亮藍染色方法1、制作標準曲線：

編號1(空白）234567樣品標準蛋白

(ml)0.00.10.150.20.30.40.50.5ml

水(ml)0.50.40.350.30.20.10.0濃度(mg/ml)0.00.050.0750.10.150.20.25C0染色液(ml)55555555OD值四、實驗步驟：蛋白質含量測定考馬斯亮藍染色方法標準蛋白質濃度OD值0樣品OD值C00.050.0750.1

0.150.20.25OD1OD2OD3OD4OD5OD6

標準曲線的制作（圖）y=ax+bR2=蛋白質含量測定考馬斯亮藍染色方法

稱取豆芽葉片1g→研缽中加2ml水→研成勻漿→轉入離心管→用水分三次沖洗研缽，每次2ml→均轉入同一離心管→等重后8000轉/分離心10分鐘→取上清液轉入25ml容量瓶→定容。2、樣品蛋白質提取：蛋白質含量測定考馬斯亮藍染色方法

取提取液于試管中,加入考馬斯亮藍G-250染色液5ml，充分混勻，放置5分鐘，以制作標準曲線的1號試管為參比溶液，調吸光度為“0”，測豆芽提取液的吸光度A595nm，記錄結果，查標準曲線，得蛋白質濃度X(mg/ml)。3、測定：蛋白質含量測定考馬斯亮藍染色方法五、結果計算：

樣品蛋白質含量（mg/g）

=[C0·提取液的總體積]/樣品鮮重(g)蛋白質含量測定考馬斯亮藍染色方法分光光度技術

利用紫外光、可見光、紅外光和激光等測定物質的吸收光譜，利用此吸收光譜對物質進行定性定量分析和物質結構分析的方法，稱為分光光度法或分光光度技術，使用的儀器稱為分光光度計.

紅外吸收光譜：波長范圍1000m,主要用于有機化合物結構鑒定。紫外吸收光譜：波長范圍200400nm（近紫外區）可用于結構鑒定和定量分析。可見吸收光譜：波長范圍400750nm，主要用于溶液等的定量分析。蛋白質含量測定考馬斯亮藍染色方法

光吸收定律：朗伯—比爾(Lambert-bee)光吸收定律：A＝lg（I0/It)＝-lgT＝εbc（1）A—吸光度“OD”：描述溶液對光的吸收程度；同一種溶液對不同波長光的吸光度是不相同的，在吸光度最大處所對應的波長稱為最大光吸收處。同一種物質不同濃度的吸光度，在某一定波長下有差異，在最大光吸收處吸光度的差異最大。這是分光光度法進行物質定量分析的重要依據。I0：表示入射光強度，It：表示光線通過溶液后的強度。蛋白質含量測定考馬斯亮藍染色方法（2）T—透光度：描述入射光透過溶液的程度；

（3）ε—摩爾吸光系數(是溶液的特征常數)，在數值上等于濃度為1mol/L、液層厚度為1cm時該溶液在某一波長下的吸光度；單位mol·L－1；（4）b—樣品光程（cm），通常使用1.0cm的吸收池，b=1cm（5）C—樣品濃度（mol/L）由上式可以看出：吸光度OD與物質的濃度“C”和溶液吸光的厚度成正比。A＝lg（I0/It)=-lgT＝εbc

蛋白質含量測定考馬斯亮藍染色方法

分光光度計的組成和構造：（1）光源；（2）單色器（3）吸收池；（4）接收檢測放大系統(檢測器)；（5）信號指示系統(顯示或記錄器)。蛋白質含量測定考馬斯亮藍染色方法

⑴光源：

用于可見光光源是鎢燈和鹵鎢

，現在最常用的是鹵鎢燈（Halogenlamp），適用波長范圍是320～1100nm。用于紫外光區的是氫燈和氘燈適用波長范圍是195～400nm。蛋白質含量測定考馬斯亮藍染色方法⑵單色器：單色器是分光光度計的心臟部分。把來自光源的混合光波分解為單一波長的光能隨意改變光的波長。單色器一般由入射狹縫、準光器（透鏡或凹面反射鏡使入射光成平行光）、色散元件、聚焦元件和出射狹縫等幾部分組成。其核心部分是色散元件:主要是棱鏡和光柵蛋白質含量測定考馬斯亮藍染色方法⑶吸收池吸收池（即比色杯）：用來盛裝被測試的溶液。光學比色杯和石英比色杯兩種。光學比色杯適用波長范圍是400nm～2000nm，只能用于可見光。石英比色杯可透過紫外光、可見光和紅外光，是最常使用的吸收池，使用波長范圍是180nm～3000nm。光程可由至10cm，最常用的是1cm池（容積3ml）蛋白質含量測定考馬斯亮藍染色方法吸收池使用注意事項：①比色杯在使用前后都要徹底的清洗。②嚴禁用手指觸摸透光面，因指紋不易洗凈。③嚴禁用硬紙和布擦拭透光面，只能使用鏡頭紙和綢布。④嚴禁加熱烘烤。急用干的杯子時，可用酒精蕩洗后用冷風吹干。決不可用超聲波清洗器清洗。

蛋白質含量測定考馬斯亮藍染色方法⑷檢測器：檢測器是一種光電轉換設備，即把光強度以電訊號顯示出來，常用的檢測器有光電管，光電倍增管和光電二極管等。

⑸顯示裝置：分光光度計現在已都使用數字顯示，有的還連有打印機。高性能分光光度計均可以連接微機，而且有的主機還使用帶液晶或CRT熒屏顯示的微處理機和打印繪圖機，有的還帶有標準軟驅，存取數據更加方便。蛋白質含量測定考馬斯亮藍染色方法偏離朗伯—比耳定律的原因

標準曲線法測定未知溶液的濃度時，發現：標準曲線常發生彎曲（尤其當溶液濃度較高時），這種現象稱為對朗伯—比耳定律的偏離。引起這種偏離的因素（兩大類）：（1）物理性因素，即儀器的非理想引起的；（2）化學性因素。蛋白質含量測定考馬斯亮藍染色方法（1）物理性因素

難以獲得真正的純單色光。朗伯—比耳定律的前提條件之一是入射光為單色光。分光光度計只能獲得近乎單色的狹窄光帶。復合光可導致對朗伯—比耳定律的正或負偏離。

非單色光、雜散光、散射光和反射光、非平行入射光都會引起對Beer-Lambert定律的偏離，最主要的是非單色光作為入射光引起的偏離。

蛋白質含量測定考馬斯亮藍染色方法(2)化學性因素

朗—比耳定律的假定：所有的吸光質點之間不發生相互作用；假定只有在稀溶液(c<10-2mol/L)時才基本符合。當溶液濃度c>10－2mol/L時，溶液中溶質可因濃度改變而有離解、締合、互變異構、配合物的形成和與溶劑間的作用，使吸光質點的濃度發生變化，影響吸光度。例：鉻酸鹽或重鉻酸鹽溶液中存在下列平衡：CrO42-＋2H＋

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