關于發酵工程在現代生物技術中的應用第1頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三第一節基因工程菌的發酵就生產流程而言，從發酵到分離、純化目標產物，工程菌和常規微生物并無太多的差異。但工程菌在保存過程中及發酵生產過程中表現出不穩定性，以及安全性等問題，使得工程菌的培養有著自身所特有的特點。第2頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三（一）工程菌的穩定性1、基因工程菌不穩定的表現生產的目標是得到最大量的外源蛋白，但是大量外源蛋白的形成對宿主細胞是有損害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白的能力的細胞一般生長得快得多，從而能替代有生產能力的菌株，這就導致基因的不穩定性。基因的不穩定性原因：質粒分離丟失、結構不穩定性表達產物的不穩定性（宿主細胞調節突變）第3頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三質粒丟失

當細胞分裂時一個子細胞沒有接受質粒就出現分離丟失。質粒可分為高拷貝質粒（>20拷貝/細胞）和低拷貝質粒（有時低到每個細胞一至二個拷貝）。低拷貝質粒有專門的機制保證在子代細胞中有相等的分配，高拷貝質粒通常很少遵循二分法分配到子代細胞。對于高拷貝質粒，幾乎所有子細胞接受一些質粒，也有可能有的細胞沒有接受質粒，當然形成無質粒細胞的可能性是低的（每百萬細胞分裂中一個）。第4頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三但在大的反應器中含有非常多的細胞，總會存在無質粒細胞，例如1000L發酵液，每毫升有109個細胞，總共就有1015個細胞，那么在這個反應器中就含有109個無質粒細胞。質粒的分離丟失可能受許多環境因素影響，如溶氧、溫度、培養基組成和恒化器中的稀釋速率。許多質粒也會形成多聚體，它是相同質粒附著在一起形成一個單位。第5頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三第6頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三質粒結構不穩定性

除了分離不穩定性問題外，某些細胞保留質粒，但質粒結構發生改變，而不產生外源蛋白，減少對細胞的有害影響，這就是結構不穩定性。如果質粒發生突變，仍保留了抗生素抗性基因，但不合成外源蛋白，那么這些突變株仍能在含有抗生素的培養基中生長。而且由于不合成外源蛋白，生長得比原來的工程菌更快，使得在這種培養物中帶有改變了的質粒占統治地位的菌，這種培養情況就是結構不穩定性。第7頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三表達產物的不穩定性宿主細胞的突變也會造成生產能力的減少。這些突變通常改變細胞調節，結果減少目標蛋白的合成。例如，控制外源蛋白表達的啟動子，利用宿主細胞的啟動子，如果宿主細胞啟動子的改變，將大大改變質粒編碼蛋白的生產水平。乳糖操縱子是常用是操縱子，通過加入乳糖或它的結構類似物（如IPTG）來啟動表達，如果乳糖操縱子編碼半乳糖苷透酶的基因發生突變就會阻止乳糖或乳糖的結構類似物進入細胞，從而不能啟動細胞的表達。第8頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三2、培養條件對工程菌穩定性的影響

對于一個已經組建完成的工程菌來說，選擇最適的培養條件是進行工業化生產的關鍵步驟。

在眾多的環境因素中，培養基的組成、培養溫度、菌體的比生長速率3個方面尤其重要。

環境因素對質粒穩定性的影響機制錯綜復雜，許多尚屬未知。第9頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三1）培養基的組成

第10頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三2）菌體比生長速率

比生長速率對重組質粒穩定性的影響結果不盡一致，并可能與克隆菌本身和培養條件有關。例如:在酵母系統中，大則質粒pJDB248穩定性高。

如果不含重組質粒的宿主細胞不比含有重組質粒的工程菌生長快，則重組質粒的丟失也不會導致非常嚴重的后果；調整這兩種菌的比生長速率可以提高重組質粒的穩定性。但很難達到第11頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三3）培養溫度通常，低溫往往有利于重組質粒穩定地遺傳。4）pH和溶解氧pH對細胞的正常生長和外源蛋白的高效表達都有影響，所以應根據工程菌的生長和代謝情況，對pH進行適當的調節溶解氧是工程菌發酵培養過程中影響菌體代謝的一個重要參數，對菌體的生長和產物的生成影響很大。外源基因的高效表達和翻譯需要維持較高水平的DO2值。通常采用調節攪拌轉速的方法，可以改善培養過程中的氧供給，提高活菌產量。第12頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三4、控制基因過量表達

提高質粒穩定性的目的是為了提高克隆菌的發酵生產率，但外源基因表達水平越高，重組質粒往往越不穩定。

可采用兩階段培養法，即在發酵前期控制外源基因不過量表達，使重組質粒穩定地遺傳；到后期通過提高質粒的拷貝數或轉錄、翻譯效率使外源基因高效表達。第13頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三1）可誘導性啟動子

在構建表達載體時，可使用可誘導性的啟動子，如：lac、trp、PL等

在用含有這些啟動子的克隆菌進行發酵生產時，可以選擇培養條件使啟動子受阻遏（抑制）到一定時期；然后去阻遏（誘導）使質粒高效表達。例如：利用3--吲哚乙酸可使trp啟動子去阻遏第14頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三2）溫度敏感型質粒

一些溫度敏感型質粒在溫度較低時質粒拷貝數較少，當溫度升高到一定值時質粒大量擴增

——脫韁質粒（runawayplasmid）

如：pKN410在30℃時的拷貝數為20～50/E.coli細胞；在35℃時質粒大量復制。

將-內酰氨酶基因接在其上，經熱誘導后，酶活可擴增400倍。第15頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三5、施加選擇壓力

從遺傳學來說，選擇意味著利用某些生長條件使得只有那些具有一定遺傳特性的細胞才能夠生長。第16頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三1）抗生素添加法通常在重組質粒上含有抗藥性基因第17頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三AmpR第18頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三AmpRTcR第19頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三

將含有抗藥性基因的重組質粒轉入不耐藥的宿主細胞后，克隆菌也獲得了抗藥性。

在克隆菌發酵時，于培養基中加入適量的相應抗生素，就可阻止丟失了重組質粒的非生產菌的生長。第20頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三但這種方法在大規模生產時并不可取,因為：成本增加對于一些易被酶水解失活的抗生素來說，添加抗生素造成的選擇壓力只能維持一定的時間添加抗生素對結構性不穩定無能為力抗生素的存在可能會影響目的產物的合成給產物的提取帶來困難第21頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三2）抗生素依賴變異法

通過誘變使宿主細胞成為某抗生素的依賴型變異株——即只有在該抗生素存在時宿主細胞才能生長。

因此在進行發酵生產時，不需要向培養基中加入抗生素就能達到消除重組質粒分配不穩定性的目的。而重組質粒上含該抗生素的非依賴性基因，將重組質粒導入宿主細胞后，所得的克隆菌就能在不含抗生素的培養基中生長。第22頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三3）營養缺陷型法

通過誘變使宿主細胞染色體缺失生長所必需的某一基因，而將該基因插入到重組質粒中。

然后選擇適當組成的培養基使失去重組質粒的細胞不能存活，而只有含重組質粒的細胞才能生長。例如：

構建帶有色氨酸操縱子的重組質粒pBR322-trp，并在該質粒上插入SerB基因；而宿主細胞是SerB缺陷型；這樣質粒與宿主形成互補，在培養過程中丟失質粒的細胞因不能合成Ser而被淘汰.第23頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三（二）、工程菌發酵工藝

不同發酵條件下工程菌發酵結果通氣量攪拌轉速DOpHOD600

誘導時間菌體濕重蛋白量111501.87.00.741.913.8%222502.67.80.7742.0816.7%335003.87.50.7462.1018.2%435004.07.00.8362.2726.4%535003.67.02.4465.1858.9%*鯉魚生長激素基因工程菌第24頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三1、培養基培養基給重組菌提供必需的營養和適宜的環境，對重組菌的生長、質粒的穩定及產物的表達有極其重要的影響，同時還要考慮到目的產物的提取和純化工藝。人畜的蛋白質發酵營養豐富容易質粒丟失第25頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三2、溶氧濃度對工程菌發酵的影響在鯉魚生長激素基因工程菌的發酵研究中發現當發酵液的溶氧為1.8~2.6ppm/L時，菌體濕重為1.9~2.08g/L外源基因表達量為13.8%~16.7%，而當溶氧值提高到4.0ppm/L時菌體濕重為2.27g/L外源基因表達量為26.4%。在誘導表達期間，要維持外源基因的高水平轉錄和翻譯，細胞需要大量的能量代謝以促進呼吸作用。因此通過增大通氣量和提高攪拌轉速以保證較大的溶氧值，不僅提高工程菌的生長而且有利于外源蛋白產物的形成。第26頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三3、比生長速率基因工程菌在培養過程中的比生長速率與重組產物的表達速率存在一定的關系，過高或過低的比生長速率均不利第27頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三4、誘導時間對外源蛋白表達的影響誘導時間：加入誘導劑后的培養時間隨著誘導時間的延長，外源蛋白的表達量增加，但外源蛋白在細胞內的積累，對重組菌產生毒性，合成速率下降，甚至產物被分解。誘導時間對酶表達水平和活力的影響誘導時間酶活力酶表達水平

00.02152.337%2118.857%3120.867%4165.068%5139.964%*L-天冬酰氨酶第28頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三5、代謝副產物的影響當葡萄糖加入量超過菌體生長和二氧化碳產生所需要量或在缺氧的條件下便會產生大量的乙酸，特別是在培養時間較長的高密度發酵過程中，問題更為嚴重。乙酸的產生與細胞中的電子傳遞鏈和三羧酸循環有關。Han認為細菌在低比生長速率下通過氧化代謝的作用產生的能量足以滿足合成和異化的需求，不會產生乙酸，而在髙比生長速率時，大腸桿菌僅靠氧化代謝不能提供足夠的能量，必須通過乙酸生成途徑儲備ATP和NADH。第29頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三(三)、安全問題關于基因工程的社會問題，必須提到它的潛在危險性。經過重組的菌和質粒一旦用于工業化生產，就不可避免地進入自然界。這些菌能間接地危害人體健康，使治療藥物失去效用，污染環境等。因此，安全問題是極其重要的。第30頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三1974年，提出了DNA重組實驗具有潛在生物危險性的問題。后來，制定了有關DNA重組實驗的準則，其目的是保證實驗的安全和推動重組DNA的研究。這些準則參照了防止病原微生物污染的措施，以及根據對實驗安全度的評定，采用物理密封(P1~P4)和生物學密封(B1和B2)兩種方法。第31頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三物理密封是將重組菌封閉于設備內，以防止傳染給實驗人員和向外界擴散。實驗規模在20L以下時，物理密封由密封設施、實驗室設計和實驗注意事項組成。密封程度分為P1、P2、P3和P4級，數字越大，密封水平越高。生物學密封要求用只有在特殊培養條件下才能生存的宿主，同時用不能轉移至其它活細胞的載體，通過這樣組合的宿主載體系統，可以防止重組菌向外擴散。按密封程度分B1和B2級，B2級的密封要求最嚴格。第32頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三第二節動、植物細胞大規模培養動植物細胞培養是指動植物細胞在體外條件下的存活或生長，此時細胞不再形成組織。第33頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三一、細胞融合技術細胞融合技術（cellfusiontechnology)，是指兩個或更多個親本細胞經酶法出去細胞壁得到兩個球狀原生質球，通過生物法、化學法或物理法等誘導融合形成單個細胞，獲得新的重組子的過程。第34頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三理論上說任何細胞，都有可能通過體細胞雜交而成為新的生物資源。這對于種質資源的開發和利用具有深遠的意義。融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機制的限制，為遠緣物種間的遺傳物質交換提供了有效途徑。體細胞雜交產生的雜種細胞含有來自雙親的核外遺傳系統，在雜種的分裂和增殖過程中雙親的葉綠體、線粒體DNA亦可發生重組，從而產生新的核外遺傳系統。淋巴細胞雜交瘤和單克隆抗體的制備。第35頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三生物種類細胞來源成功年代煙草兩個種間苷藍——青菜大豆——馬唐草矮牽牛——龍面花大麥——花生大麥——大豆小麥——矮牽牛油菜——大豆玉米——大豆大豆——野豌豆大麥——蠶豆大豆——草香木犀酵母菌——雞大豆——煙草大豆——秋水仙人——胡蘿卜番茄——馬鈴薯人——小鼠葉——葉葉——根愈傷組織——葉葉——花瓣種子——種子葉——懸浮細胞葉——花瓣葉——懸浮細胞葉——懸浮細胞懸浮細胞——懸浮細胞葉——根懸浮細胞——葉原生質體——血紅細胞懸浮細胞——葉懸浮細胞——葉腹水癌細胞——原生質體葉——根尖纖維肉瘤細胞——畸胎瘤細胞197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972幾種細胞融合成功的例子第36頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三細胞的融合過程植物細胞融合過程人造小鼠培育過程示意圖第37頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三（一）原生質體的制備影響原生質體制備的因素：1、親本的選擇及預處理微生物細胞——取對數期細胞，培養基中加入細胞壁合成抑制劑，可以增加菌體對脫壁酶的敏感性植物細胞——一般選擇活躍生長器官和組織細胞，由此制得的原生質體生活力較強，再生分化比例較高。常用的外植體包括：種子根、子葉、下胚軸、胚細胞、花粉母細胞、懸浮培養細胞和嫩葉第38頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三2、除壁酶的選擇細菌放線菌用溶菌酶處理酵母菌用蝸牛酶處理霉菌用幾丁質酶和纖維素酶配合植物細胞一般用混合酶第39頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三3、酶濃度酶濃度增加，原生質體的形成率也增大，酶濃度過低不利于原生質體形成，酶濃度過高則導致原生質體再生率的降低4、酶解溫度20~40℃5、酶解時間酶解時間過長，原生質體再生率降低6、滲透壓穩定性原生質體對溶液和培養基的滲透壓很敏感，必須在高滲透壓或等滲透壓下才能維持第40頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三（二）原生質體融合融合是把兩個親本原生質體混合在一起，通過誘導融合作用使原生質體發生融合。1、生物學法主要用于動物細胞融合該法由于病毒的致病性和寄生性，制備比較困難，誘導產生的細胞融合率比較低，重復性不高，近年不多用第41頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三用滅活的病毒誘導的動物細胞融合過程示意圖

第42頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三

優點是易得，用法簡單，融合效果穩定。應用最廣泛的化學融合劑聚乙二醇(PEG)聚乙二醇(PEG)結構為：HOH2C（CH20CH2）nCH2