凱氏定氮法測定食品中蛋白質演示文稿本文檔共30頁；當前第1頁；編輯于星期二\10點30分凱氏定氮法

測定食品中蛋白質本文檔共30頁；當前第2頁；編輯于星期二\10點30分一、概述

蛋白質是以氨基酸為最小構成單元的大分子的含氮化合物，它是由20種氨基酸通過酰氨鍵以一定方式結合，并具有一定的空間結構。3本文檔共30頁；當前第3頁；編輯于星期二\10點30分1生命的物質基礎3遺傳信息的表達方式5人及動物需要從食品得到蛋白質及其分解產物，來構成自身的蛋白質2維持酸堿平衡、水平衡4維持物質的代謝及運轉6營養指標、食品生產工藝指標。生理功能及在食品中的作用本文檔共30頁；當前第4頁；編輯于星期二\10點30分常見食物中蛋白質的含量牛肉螺旋藻5本文檔共30頁；當前第5頁；編輯于星期二\10點30分常見食物氮系數氮系數：蛋白質含氮量的倒數，常用6.25表示。6本文檔共30頁；當前第6頁；編輯于星期二\10點30分蛋白質測定方法方法時間應用范圍優缺點凱氏定氮法8-10h0.2-1.0mg氮時間長雙縮脲法20-30min1-10mg氮靈敏度低、快速檢測Folin－酚試劑法40-60min<5mg氮靈敏度高、耗時長、試劑配制困難紫外吸收法考馬斯亮藍法5-10min5-15min50-100mg蛋白質0～0.1mg/mL層析柱流出物檢測較好，標準曲線有輕微非線性7本文檔共30頁；當前第7頁；編輯于星期二\10點30分二、凱氏定氮法測定蛋白質（粗蛋白）

凱氏定氮法是通過測出樣品中的總含氮量再乘以相應的蛋白質系數而求出蛋白質的含量。1.原理1樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出2樣品中的有機氮轉化為氨與硫酸結合成硫酸銨3加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以標準鹽酸溶液滴定本文檔共30頁；當前第8頁；編輯于星期二\10點30分消化蒸餾吸收、滴定計算2.實驗步驟本文檔共30頁；當前第9頁；編輯于星期二\10點30分第一步：樣品消化

樣品與濃硫酸加熱消化，硫酸使有機物脫水并破壞有機物，C、H氧化為二氧化碳、水逸出，蛋白質分解為氨、與硫酸結合生成硫酸銨、留在溶液中

對原子的前處理，使被測物質進入溶液中，使不溶變為可溶、有機物分解為可溶性無機物消化本文檔共30頁；當前第10頁；編輯于星期二\10點30分（1）消化總反應式：2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O一定要用濃硫酸（98%）11本文檔共30頁；當前第11頁；編輯于星期二\10點30分消化裝置“自動回流消化儀”本文檔共30頁；當前第12頁；編輯于星期二\10點30分定氮消化的不同狀態RCH2(NH2)COOH+H2SO4→CO2+H2O+SO2+(NH4）2SO4澄清消泡碳化本文檔共30頁；當前第13頁；編輯于星期二\10點30分消化過程中試劑作用硫酸鉀：提高溶液沸點、加快反應進程；硫酸銅（藍綠色）：催化作用褐色本文檔共30頁；當前第14頁；編輯于星期二\10點30分(NH4)2SO4+2NaOH→NH3+Na2SO4+2H2O第二步——蒸餾本文檔共30頁；當前第15頁；編輯于星期二\10點30分01氫氧化鈉需過量、若不夠，會生成H2S,H2S是強酸，會使溶液顏色變紅02防止樣液中氨氣逸出。注意事項：本文檔共30頁；當前第16頁；編輯于星期二\10點30分(3）吸收與滴定吸收：加熱蒸餾所放出的氨，硼酸溶液滴定：鹽酸標準溶液，

硼酸呈微弱酸性（Ka1=5.8×10-10），用酸滴定不影響指示劑的變色反應，它有吸收氨的作用

硫酸、鹽酸溶液也可用作吸收劑。本文檔共30頁；當前第17頁；編輯于星期二\10點30分各步驟操作細節圖解：

樣品消化→蒸餾→滴定（1）樣品消化樣品+0.4g硫酸銅+6g硫酸鉀+20ml濃硫酸+玻珠數粒先小火炭化，無泡沫后，加大火力，液體變藍綠透明，繼續加熱微沸30分鐘45度角消化終點瓶口不能對著人蓋上小漏斗18本文檔共30頁；當前第18頁；編輯于星期二\10點30分（2）蒸餾將消化液全部轉移到100ml容量瓶中加10ml硼酸溶液和混合指示劑2～3d加入NaOH溶液后顏色為深藍色或褐色通入蒸汽開始蒸餾冷凝管下口浸入硼酸溶液中取10ml消化稀釋液沿小玻璃杯移入反應室，少量蒸餾水沖洗，塞緊棒狀玻璃塞，向小玻璃杯內加入10ml40%NaOH,提起玻璃塞，使NaOH緩慢流入反應室，立即塞緊玻璃塞，并在小玻璃杯中加水使之密封。19本文檔共30頁；當前第19頁；編輯于星期二\10點30分吸收液變藍色后繼續蒸餾5分鐘，將冷凝管尖端提離液面再蒸餾1min，用蒸餾水沖洗冷凝管尖端，取下接收瓶，關閉電源20本文檔共30頁；當前第20頁；編輯于星期二\10點30分（3）滴定取下接收瓶，用0.1000mol/L的鹽酸或硫酸標準溶液滴定至終點。滴定前滴定終點同時做一試劑空白實驗，記錄空白滴定消耗鹽酸的體積。21本文檔共30頁；當前第21頁；編輯于星期二\10點30分實驗注意事項—消化（1）不時轉動凱氏燒瓶、緩和沸騰消化（2）消化至呈透明后，繼續消化30分鐘，一般消化時間約4小時（3）可加如少量辛醇、硅油做消泡劑（4）樣品不易澄清時可冷卻后加入30%過氧化氫2-3ml22本文檔共30頁；當前第22頁；編輯于星期二\10點30分小結本文檔共30頁；當前第23頁；編輯于星期二\10點30分24本文檔共30頁；當前第24頁；編輯于星期二\10點30分自動凱氏定氮儀法在凱氏定氮法的基礎上發展起來的自動凱氏定氮儀法，具有安全、高效、準確的優點。儀器：消化爐自動蒸餾裝置25本文檔共30頁；當前第25頁；編輯于星期二\10點30分

1、原理及適用范圍2、特點：

（1）消化裝置用優質玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。（2）快速：一次可同時消化8個樣品，30分鐘可消化完畢。（3）自動：自動加堿蒸餾，自動吸收和滴定，自動數字顯示裝置。可計算總氮百分含量并記錄，12分鐘完成1個樣。26本文檔共30頁；當前第26頁；編輯于星期二\10點30分雙縮脲法（分光光度法）1.原理——雙縮脲反應

堿性條件下、雙縮脲與硫酸銅作用生成紫紅色配合物的反應。

肽鍵（-CO-NH-）與雙縮脲結構相似、能呈現此反應。

560nm處、由顏色深淺判定蛋白質含量多少。KOH、CuSO4、酒石酸鉀鈉配置27本文檔共30頁；當前第27頁；編輯于星期二\10點30分標準曲線標準曲線（standardcurve）是指通過測定一系列已知組分的標準物質的某理化性質，而得到的性質的數值曲線。本文檔共30頁；當前第28頁；編輯于星期二\10點30分2.標準曲線繪制（1）配置一定濃度（10mg/ml）的蛋白質標準溶液；（2）分別量取4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml蛋白質標準液于7支50ml比色管中；（3）向上述7支試管中分別加入1ml四氯化碳后、用堿性酒石酸銅溶液稀釋至50ml，振搖、靜止1h