染料木素對肝損傷后促進肝功能恢復的實驗研究【摘要】目的探討染料木素對硫代乙酰胺所致肝損傷的保護作用，并分析其可能的臨床應用價值。方法Wistar雄性大鼠腹腔給予硫代乙酰胺法建立急性肝損傷模型。肝損傷的同時，治療組皮下給予溶于DMSO的染料木素，對照組皮下給予二甲基亞砜，正常組由同樣途徑給予生理鹽水。在最后一次注射硫代乙酰胺36h后分析大鼠外周血中肝功能指標，并進行肝病理學分析。結果在建模1周內對照組死亡4只，治療組和正常組未出現死亡()。治療組和對照組大鼠體重顯著減輕，在停止注射TAA36h后，三組行非參數統計比較，發現除乳酸脫氫酶差異無統計學意義外，谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶(AST)、總膽紅素(TBIL)、谷氨酰轉移酶(γ-GT)、堿性磷酸酶(ALP)、膽汁酸均存在明顯差異。治療組與對照組比較，除AST、γ-GT無統計學差異外，ALT、TBIL、ALP、TBA、LDH都存在不同程度的降低。但各組病理學檢查未發現有明顯差異。結論染料木素對肝損傷后肝功能恢復有一定的促進作用。

【關鍵詞】染料木素硫代乙酰胺肝損傷

【Abstract】ObjectiveToexploretheprotectioneffectofgenisteinonhepaticinjuryinducedbyTAAanditspossibleclinicalapplication.MethodsAcutehepaticinjurymodelonWistarmaleratswasconstructed.ThetreatmentgroupwasgivengenisteininDMSO，thecontrolgroupwasgivendimethylsulfoxide(DMSO),theblankcontrolgroupwasgivennormalsodium.Theliverfunctionparameterofratswasanalyzed36hourslaterafterthelastTAAwasgiven,andthepathologicalchangleofliverwasanalyzedtoo.ResultsDuringoneweekofmodeling,fourratsofthecontrolgroupdied(deathrate%),thetreatmentgroupandtheblankcontrolgrouphadnodeath(p=).Theweightsofratsofthetreamentgroupandthecontrolgroupwerereducedsignificantly(),36hourslaterafterstoppinggivingTAA,differentindiceofthreegroupswerecomparedwithnonparametricstatistics.Comparedwithblankcontrolgroupgroup,thereweresignicificantdifferenceinglutamate-pyruvatetransaminase(ALT)、aspartateaminotransferase(AST)、totalbilirubin(TBIL)、glutamyl-transferase(γ-GT)、alkaliphosphatase(ALP)andbileacid(TBA)()intreatmentgroupandcontrolgroups()exceptthelactatedehydrogenase(LDH).TherewassignificantdifferenceinALT、TBIL、ALP、TBA、LDHbetweentreatmentgroupandcontrolgroup,exceptASTandγ-GT().therewasnoobviouslydifferenceinpathologyinallgroups.ConclusionsGenisteinhasprotectioneffectsonlivefuntionafterhepaticinjury.

【Keywords】genisteinthioacetamide(TAA)hepaticinjury

肝損傷是肝細胞在外來因素干預下發生氧化應激、炎癥反應、細胞破壞的過程，反復的肝細胞破壞和修復導致肝纖維化。染料木素是大豆提取物中異黃酮類的主要成分，以往有實驗證實其具有抗氧化、抑制免疫激活和抗纖維細胞增殖的作用，可能具有對肝損傷的保護作用和有利于肝纖維化的預防。但目前國內外尚無相關的實例研究報道，本實驗旨在建立持續的肝損傷模型，在染料木素干預下，觀察其對恢復階段肝功能的影響和其對肝臟的保護作用，為進一步探討其肝保護作用和治療肝纖維化價值提供實驗基礎。

1材料與方法

材料清潔級雄性Wistar大鼠32只，體重250g，購于溫州醫學院實驗動物中心。TAA購于上海凌峰化學試劑有限公司，DMSO購于汕頭西隴化工廠，染料木素購于華昌生物有限公司。ALT、AST、TBIL、DBTIL、γ-GT、ALP、TBA、LDH試劑購于科華東菱公司。

實驗分組正常組由同樣的腹腔、皮下途徑給予生理鹽水(n=8)，對照組建立肝損傷模型同時每天給予DMSO(n=12)，治療組在肝損傷模型基礎上每天給予溶解于DMSO的染料木素(n=12)。

肝損傷模型將TAA溶解于生理鹽水中，每只大鼠按100mg/kg腹腔注射TAA溶液，1次/d，共連續7d。

給藥及觀察治療組在建模開始前1d即給予染料木素，每24h給藥1次。腹腔注射TAA同時對照組皮下注射/(kg·d)DMSO，或60mg/染料木素，溶劑為/(kg·d)的DMSO，正常組由同樣的腹腔、皮下途徑給予等量生理鹽水。每天觀察動物2次，記錄大鼠體重及一般狀態。

肝功能檢測停止注射TAA溶液36h后，在乙醚麻醉下，通過下腔靜脈取血，肝素抗凝。所得血經1500rpm離心立即送檢，ALT、AST、TBIL、DBTIL、γ-GT、ALP、TBA、LDH指標采用酶法在日立7600自動分析儀上檢測。

病理檢測取肝臟固定于4％多聚甲醛，按常規包埋、制片、HE染色，光鏡下觀察肝細胞形態。

其他實驗室定期紫外線照射，注射用針頭和現配的藥物保持無菌，以排除感染對實驗的影響。

2結果

染料木素降低大鼠肝損傷的病死率在模型建立過程中，對照組大鼠死亡4只，治療組和正常組未出現死亡，對照組病死率明顯高于治療組和正常組(P＜)。對照組、治療組與正常組大鼠比較，體重有顯著減輕，模型第4天，正常組體重明顯重于治療組和對照組［正常組g、治療組g、對照組g，］，治療組體重明顯高于對照組。實驗結束時，正常組體重值最高［正常組g，治療組g，對照組g，］，治療組體重仍然高于對照組。對照組大鼠精神較治療組明顯萎靡。

染料木素有利于肝功能恢復肝損傷恢復期，正常組、治療組在血漿AST、TBIL、γ-GT、ALP、TBA等指標上差異非常顯著，而在ALT、LDH指標上差異無顯著性。而對照組與治療組之間在ALT、TBIL、ALP、TBA、LDH指標上存在不同程度的差異()，而在AST、γ-GT指標上兩者無明顯差異()，見表1。

病理觀察HE染色后對恢復期肝臟細胞變性、壞死、炎性細胞浸潤等情況進行觀察，發現除對照組局部偶見細胞變性改變外，對照組、治療組和正常組細胞形態均未見明顯病理改變。

表1各組肝功能指標比較略

3討論

染料木素是大豆中含有的一種異黃酮，其結構與雌激素相似,可通過多種化學或離心法提取。主要在人體腸道內代謝和吸收，再轉運至肝臟，通過腎臟排泄。染料木素除具有類雌激素的作用外，還具有抗氧化應激、抗炎、穩定細胞膜和抗細胞增殖的作用，為潛在的抗纖維增生劑［１］。諸多肝硬化模型中以TAA誘導的模型最接近人類，模型相對穩定，具較好的應用價值。染料木素具有雌激素樣作用，為排除雌性大鼠的雌激素對實驗的干擾，故選用雄性大鼠。肝纖維化是肝細胞不斷損傷和修復導致的結果，減少肝損傷是抗肝細胞纖維化的關鍵。肝功能可間接反映肝損傷,故有必要探討染料木素治療后大鼠在肝損傷恢復期的肝功能情況。

本實驗表明，染料木素可以明顯降低肝損傷大鼠的病死率。治療組大鼠體重雖較正常組有減低，但明顯優于對照組，間接反映了其對肝功能的保護作用。實驗中還發現治療組使用染料木素后肝功能各項指標優于對照組。TAA是急性肝毒性化合物，停止給藥14h后肝功能即可逐漸恢復，表現為ALT等肝損傷標志物的下降。本實驗中，持續肝損傷停藥后36h，3個組別肝功能均有所恢復，其中治療組與正常組在ALT、LDH兩項指標上已無明顯區別，而對照組ALT、TBIL、ALP、TBA、LDH明顯高于治療組，其中以TBA、ALT為顯著，即肝功能恢復比治療組慢，提示染料木素起到了促進肝損傷后肝功能恢復的作用。

以往已有實驗證實染料木素具有多種功效，能改善和減少肝臟的氧化應激，減少膜蛋白質的氧化和氧化所致的DNA損害，穩定細胞膜，同時增加肝臟抗氧化酶的活性和表達，協同消除自由基［２，３］，能減少炎癥介質如中性粒細胞趨化因子、IL、粘附分子的表達和活性［４，５］，還能通過影響mRNA、EGF、NF-KB、細胞周期而對抗纖維細胞增殖［６～８］。TBA、TBIL、ALT是提示肝細胞損傷的主要指標，TBIL反映了肝損傷后細胞破壞和膽紅素代謝障礙，TBA反映了肝細胞的功能，ALT存在于肝細胞內，它們在肝細胞破壞時會升高。本實驗中治療組大鼠的TBA、TBIL、ALT均明顯低于對照組，提示治療組大鼠的肝細胞破壞少、肝功能相對較好，反映了染料木素能減少肝細胞的破壞和促進肝細胞損傷后的肝功能恢復，對受損的肝細胞起保護作用。此外，LDH、ALP、AST在急性肝損傷也會增高，本實驗的LDH、ALP、AST結果也反映了染料木素的肝保護作用。氧化應激、炎癥反應等是造成肝細胞損傷的始動原因，治療組的肝損傷少反映了染料木素的抗氧化應激、抗炎作用，此作用機制與減少肝損傷和促進肝功能恢復的結果是一致的。

目前，臨床治療肝硬化缺乏有確切療效的藥物，染料木素作為一種大豆提取物，來源方便廣泛，可阻斷肝損傷的始動，促進肝功能恢復，并因抗纖維細胞增殖作用，可以為臨床治療肝損傷、肝硬化提供新藥物。

【參考文獻】

1苗慧，趙海，戚天勝．大豆異黃酮的研究進展．國外醫學中醫中藥分冊，2005,27(2):86～89.

2AnejaR,UpadhyayaG,PrakashS,etal.AmelioratingeffectofphytoestrogensonCCl4-inducedoxidativestressintheliversofmaleWistarCellsBloodSubstitImmobilBiotechnol,2005,33(2):201～213.

3LeeJS.Effectsofsoyproteinandgenisteinonbloodglucose,antioxidantenzymeactivities,andlipidprofileinstreptozotocin-induceddiabeticSci,2006,79(16):1578～1584.

4ZhaoJH,AraoY,SunSJ,etal.Oraladministrationofsoy-derivedgenistinsuppresseslipopolysaccharide-inducedacuteliverinflammationbutdoesnotinducethymicatrophyintheSci,2006,78(8):812～819.

5BekticJ,GuggenbergerR,EderIE,etal.MoleculareffectsoftheisoflavonoidgenisteininprostateProstateCancer,2005,4(2):124～129.

6PanJS,ZhuHJ,ZhangB,etal.Inhibitiveeffectofgenisteinonhypoxia-inducedbasicfibroblastgrowthfactorexpressioninhumanretinalpigmentepitheliumOculPharmacolTher,2006,22(2):103～109.

7GongL