山茱萸總苷分離純化工藝研究【摘要】目的應(yīng)用大孔吸附樹(shù)脂對(duì)山茱萸中環(huán)烯醚萜苷類(lèi)成分進(jìn)行分離純化，考察大孔樹(shù)脂純化山茱萸總苷的工藝參數(shù)。方法考察上樣量、洗脫劑濃度、洗脫體積、上樣濃度等因素對(duì)HPD-100大孔吸附樹(shù)脂純化山茱萸環(huán)烯醚萜苷的影響。以洗脫液中莫諾苷和馬錢(qián)苷含量作為考察指標(biāo)，用HPLC法測(cè)定其含量，確定最佳工藝參數(shù)。結(jié)果洗脫溶劑應(yīng)為50%乙醇，大孔樹(shù)脂每使用兩次需要再生1次，最佳上樣濃度為g/ml，洗脫溶劑的用量為8倍的吸附原液體積，吸附容量為10ml。結(jié)論采用大孔樹(shù)脂分離純化的山茱萸總苷可用于制備環(huán)烯醚萜苷制劑。

【關(guān)鍵詞】山茱萸總苷；大孔吸附樹(shù)脂；高效液相色譜法；純化

Abstract：ObjectiveTostudythetechnologicalparametersofpurificationoftotalglycosidefromCornusofficinaliswithmacroporoussamplevolume,elutionconcentration,volumeandsampleconcentrationwereobservedandcomparedwiththoseelutionsolvents.ThepurificationofiridoidglycosideswasevaluatedwithcontentsofmorronisideandloganinbyHPLCmethods．ResultsElutingsolventwas50%ethanol,themacroporousresinusedtwicenecdedtoberenewed,thebestsampleconcentrationwasg/ml,thevolumeofelutingsolventwaseighttimestheofvolumeofsamplesolution,theabsorptioncapacitywas10ml.ConclusionIridiodglycosidecanbepurifiedbymacroporous．Itisafeasiblemethodtoproducepreparation．

Keywords：TotalglycosidesfromComusofficinalis;Macroporousresin;HPLC;Purification

山茱萸總苷(TotalglucosidesfromCornusofficinalis，TGC)為中藥山茱萸的主要藥效部位，包括馬錢(qián)苷、莫諾苷、獐牙菜苷、馬鞭草苷、山茱萸新苷等十余種環(huán)烯醚萜苷，已經(jīng)證實(shí)能夠降血糖并對(duì)糖尿病心臟和腎病病變有一定的保護(hù)作用［1～3］，有抗炎、免疫抑制作用［4～6］，對(duì)阿爾采末病和腦梗塞有治療作用［7～8］。大孔吸附樹(shù)脂對(duì)單味中藥提取物中苷類(lèi)、黃酮、生物堿的分離純化效果良好［9，10］。本工藝應(yīng)用大孔吸附樹(shù)脂對(duì)山茱萸中環(huán)烯醚萜苷類(lèi)成分進(jìn)行分離純化，并考察大孔樹(shù)脂純化山茱萸總苷的參數(shù)。

1儀器與試藥1儀器

Agilent1100Series高效液相色譜儀；KDC-16H高速型離心機(jī)；BT125D十萬(wàn)分之一天平；Heidolph2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。2藥品與試劑

山茱萸藥材購(gòu)于唐山市醫(yī)藥藥材公司；馬錢(qián)苷、莫諾苷對(duì)照品；HPD-100大孔樹(shù)脂；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為重蒸餾水。

2方法與結(jié)果

山茱萸吸附原液的制備

稱(chēng)取山茱萸粉200g，加8倍量30％乙醇浸泡過(guò)夜，回流提取2次，1h/次，過(guò)濾，合并濾液，濾液回收乙醇，濃縮制成每毫升相當(dāng)于g生藥的溶液，靜置，濾過(guò)，即得山茱萸吸附原液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

大孔吸附樹(shù)脂預(yù)處理與再生

大孔吸附樹(shù)脂一般含有未聚合的單體及殘留溶劑，使用前須先行除去。樹(shù)脂用95%乙醇浸泡24h，傾去上浮物后濕法裝柱，用乙醇洗至流出液與水混合不呈現(xiàn)白色乳濁現(xiàn)象即可，然后以大量蒸餾水洗凈柱中乙醇，水浸泡備用；再生時(shí)用90％乙醇洗脫至流出液無(wú)色，以大量水洗去乙醇即可。如果樹(shù)脂顏色較深，用mol/L氫氧化鈉溶液浸泡2h，用水洗至中性，再加mol/L鹽酸溶液浸泡2h，用水洗至中性，最后用95%乙醇洗至洗脫液與等體積水混合不渾濁，用蒸餾水洗至無(wú)醇，備用。

山茱萸總苷中莫諾苷和馬錢(qián)苷的含量測(cè)定

色譜條件

色譜柱為DiamonsilC18色譜柱；流動(dòng)相為甲醇-水溶液梯度洗脫，洗脫劑甲醇在0～8min為32%，在8～15min為32%～36%，在15～20min為36%；柱溫為室溫；流速1ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)237nm；進(jìn)樣量20μl。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與線(xiàn)性范圍

配制莫諾苷和馬錢(qián)苷的系列對(duì)照品溶液，20μl進(jìn)樣分析。以莫諾苷和馬錢(qián)苷的峰面積為縱坐標(biāo)，莫諾苷和馬錢(qián)苷的濃度為橫坐標(biāo)，經(jīng)回歸處理得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程。其中莫諾苷為Y=25404C+，馬錢(qián)苷為Y=20518C+。莫諾苷和馬錢(qián)苷在6～mg/ml范圍內(nèi)線(xiàn)性良好。

HPD-100大孔樹(shù)脂純化山茱萸總苷工藝參數(shù)的研究

洗脫溶劑的確定

取HPD-100大孔樹(shù)脂20g，濕法裝柱，預(yù)處理后備用。分別取g/ml的吸附原液5ml，5支大孔樹(shù)脂柱上樣，通過(guò)進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附。用水洗脫樹(shù)脂柱至洗脫液近無(wú)色，再用10%，30%，50%，70%，95%乙醇50ml洗脫，收集洗脫液，定容50ml，測(cè)定莫諾苷和馬錢(qián)苷的含量。結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知山茱萸總苷最佳洗脫劑為50%乙醇。

大孔樹(shù)脂使用次數(shù)的確定

在“”條件下，將樹(shù)脂處理后再進(jìn)行第2次和第3次上樣洗脫，考察樹(shù)脂的重復(fù)利用情況，根據(jù)莫諾苷和馬錢(qián)苷的含量確定樹(shù)脂使用次數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知SPF-100大孔樹(shù)脂的最佳洗脫次數(shù)為兩次。表1洗脫溶劑及樹(shù)脂使用次數(shù)測(cè)定結(jié)果

最佳上樣濃度的確定

取不同濃度的山茱萸吸附原液5ml，用50%乙醇50ml洗脫，收集洗脫液，定容50ml，測(cè)定莫諾苷和馬錢(qián)苷的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知SPF-100大孔樹(shù)脂的最佳上樣濃度為g/ml的吸附原液。表2不同上樣濃度的含量測(cè)定結(jié)果

洗脫溶劑的用量

分別取g/ml的吸附原液5ml，大孔樹(shù)脂柱上樣，用水洗脫樹(shù)脂柱至洗脫液近無(wú)色，再分別用50%乙醇30ml(6倍），40ml(8倍），50ml洗脫，收集洗脫液，定容50ml，測(cè)定莫諾苷和馬錢(qián)苷的含量。結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知SPF-100大孔樹(shù)脂的洗脫溶劑的用量10倍的吸附原液體積，但綜合考慮洗脫溶劑用量及回收溶劑等因素，可選8倍量的洗脫溶劑。表3不同洗脫溶劑用量的含量測(cè)定結(jié)果

吸附容量的測(cè)定

分別取g/ml的吸附原液5，10，15，20ml，大孔樹(shù)脂柱上樣，用水洗脫樹(shù)脂柱至洗脫液近無(wú)色，再分別用50%乙醇50ml洗脫，收集洗脫液，定容50ml，測(cè)定莫諾苷和馬錢(qián)苷的含量。結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知SPF-100大孔樹(shù)脂在吸附原液為5ml時(shí)吸附最完全，但綜合考慮，吸附原液為10ml時(shí)效率最高。表4不同吸附容量的含量測(cè)定結(jié)果

3討論

大孔樹(shù)脂精制苷類(lèi)具有吸附容量大、洗脫效率高等優(yōu)點(diǎn)，使馬錢(qián)苷和莫諾苷的含量提高，在預(yù)處理的前提下不失為一種提取苷類(lèi)的優(yōu)良吸附劑。

中藥成分在樹(shù)脂上的吸附可能為放熱過(guò)程，低溫有利于提高中藥成分的比上柱量，因此上樣前將吸附原液放冰箱低溫處理可增大吸附量。吸附原液上柱前，必須進(jìn)行抽濾或離心等預(yù)處理以除去沉淀和雜質(zhì)，上樣液愈澄清，山茱萸總苷的純化率愈高，亦能提高樹(shù)脂的使用壽命。

曾采用紫外法測(cè)定山茱萸總苷的含量，但是經(jīng)大孔樹(shù)脂富集后得到的總苷在237nm左右并沒(méi)有最大吸收峰，加上紫外法干擾多，特別是在中藥成分復(fù)雜的情況下很難確定其準(zhǔn)確性，莫諾苷和馬錢(qián)苷是山茱萸總苷中含量最高的兩種環(huán)烯醚萜苷，約占總苷的85％，故選用了HPLC法同時(shí)測(cè)定莫諾苷和馬錢(qián)苷的方法確定山茱萸總苷的分離純化工藝。

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