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文檔簡介

多聚酶鏈式反應第一頁，共十三頁，編輯于2023年，星期日一、實驗原理：PCR又稱多聚酶鏈式反應，是一種體外酶促合成特異DNA片段的方法，主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個步驟反復的熱循環構成：即在高溫下，待擴增的靶DNA雙鏈受熱變性成為兩條單鏈DNA模板；而后在低溫情況下，兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補的單鏈DNA模板結合，形成部分雙鏈；在Taq酶的最適溫度（72℃）下，以引物3’端為合成的起點，以單核苷酸為原料，Mg2+存在下，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新鏈。這樣，每一雙鏈的DNA模板，經過一次解鏈、退火、延伸三個步驟的熱循環后就成了兩條雙鏈DNA分子。如此反復進行，每一次循環所產生的DNA均能成為下一次循環的模板，每一次循環都使兩條人工合成的引物間的DNA特異區拷貝數擴增一倍，PCR產物得以指數形式迅速擴增，經過25～30個循環后，理論上可使基因擴增數百萬倍。第二頁，共十三頁，編輯于2023年，星期日１．DNA模板：反應中DNA量在50ng～200ng左右。且DNA純度較高，以增加反應特異性。２．dNTP:反應體系中達100μM～200μM。３．Mg2+：Mg2+是Taq酶的輔基濃度在2.0mM左右，濃度太低Taq酶活力降低；太高反應特異性降低。４．引物：根據目的基因兩側特定序列設計。引物約20堿基左右；G+C含量在40％－70％之間；引物內部不能有回該序列；引物３’端不能互補。５．Taq酶：它是從嗜熱桿菌中提取的耐熱性ＤＮＡ聚合酶，在95℃時30分鐘還有50％活力。說明第三頁，共十三頁，編輯于2023年，星期日PCR過程示意圖第四頁，共十三頁，編輯于2023年，星期日

二、實驗所需器材和試劑器材：臺式高速離心機，恒溫水浴鍋，PCR擴增儀，瓊脂糖凝膠電泳系統，凝膠成像系統，Eppendorf離心管，PCR小管

第五頁，共十三頁，編輯于2023年，星期日試劑：

引物1，引物2，dNTPmix，10XPCRBuffer，TaqDNA聚合酶，EB，上樣緩沖液，marker，瓊脂糖，TBE緩沖液第六頁，共十三頁，編輯于2023年，星期日三、實驗步驟1：加樣按次序在PCR小管中加入下列試劑（50ul體系）：

5ul10XPCRBuffer4uldNTPmix2ul引物12ul引物23ul模板

1ulTaqDNApolymerase

加水到總體積50ul第七頁，共十三頁，編輯于2023年，星期日第八頁，共十三頁，編輯于2023年，星期日注意事項：同時設立對照組（對照組不加模板DNA）第九頁，共十三頁，編輯于2023年，星期日2、按以下參數進行PCR擴增（對于不同的PCR反應應設置不同的反應條件）94℃4分鐘94℃30秒51℃30秒進行30個循環72℃30秒72℃5分鐘4℃

第十頁，共十三頁，編輯于2023年，星期日將實驗組與對照組放入PCR儀，按設定好的條件進行擴增第十一頁，共十三頁，編輯于2023年，星期日3、擴增結束后，取5ul產物進行瓊脂糖凝膠電泳以觀察結果PCR結果示意圖第

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